藤茶提取物對(duì)素肉丸冷藏期間脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的抗氧化活性影響

張 煊，徐 玉，薛 海，姜國(guó)川，閆曉慧*，劉學(xué)軍,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林工商學(xué)院旅游學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130507；3.吉林工商學(xué)院財(cái)稅學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130507）

食品在冷藏期間會(huì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致其顏色、味道和質(zhì)地均會(huì)發(fā)生變化，影響其品質(zhì)[1-3]。食品腐敗變質(zhì)主要是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致，而研究者普遍認(rèn)為這兩種類型的氧化主要通過自由基鏈反應(yīng)發(fā)生[4-5]。因此，為了延緩食品的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化，向食品中添加抗氧化劑十分必要。目前主要有兩類抗氧化劑：1）合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚和叔丁基氫醌；2）天然抗氧化劑，如多酚、脂溶性維生素（生育酚和類胡蘿卜素）、水溶性維生素（抗壞血酸）和黃酮類化合物等[6-7]。天然抗氧化劑由于其比合成抗氧化劑更健康和安全而成為熱門研究對(duì)象。據(jù)報(bào)道，來自植物原料（如水果、蔬菜、草藥、香料及其成分）的提取物是天然抗氧化劑的良好來源[8-9]。

藤茶（Ampelopsis grossedentata）為葡萄科蛇葡萄屬[10]，俗稱莓茶、端午茶、藤婆茶，廣泛分布于中國(guó)南方[11]。藤茶中富含黃酮類物質(zhì)，其中二氫楊梅素是藤茶黃酮的主要成分[12]。據(jù)先前的研究報(bào)道，藤茶提取物（vine tea extract，VTE）具有多種生物活性，如抗菌[13]、降血脂[14]、降血糖[15]、抗氧化[16-18]等，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。此外，研究表明，VTE可以顯著抑制脂質(zhì)氧化。王文龍等[19]測(cè)定了VTE對(duì)豬油的抗氧化活性，結(jié)果表明，用VTE處理的豬油樣品的過氧化值（peroxide value，POV）顯著低于特丁基對(duì)苯二酚和對(duì)照組。Ye Liyun等[20]的研究表明，VTE可以顯著抑制碎牛肉中硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的增加。大豆拉絲蛋白是一類新型休閑食品工業(yè)用原料，是以大豆分離蛋白為主要原料，經(jīng)過特殊的工藝和設(shè)備，在可靠的操作系統(tǒng)控制下，生產(chǎn)出來的一種富含蛋白質(zhì)且具有肌肉纖維結(jié)構(gòu)的蛋白產(chǎn)品。大豆拉絲蛋白具有良好的咀嚼感，其氨基酸組成比例與人體所需的氨基酸比例接近，容易吸收利用，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[21]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)VTE的研究多集中在其有效成分提取和生物活性上，研究VTE對(duì)仿肉產(chǎn)品貯藏期間脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化的影響的報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)以大豆拉絲蛋白為原料制作素肉丸，研究了VTE對(duì)素肉丸冷藏期間發(fā)生的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的抗氧化效果，以期保持素肉丸貯藏過程中的品質(zhì)和延長(zhǎng)保質(zhì)期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆拉絲蛋白 河南品正食品科技有限公司。

藤茶、二氫楊梅素、2,4-二硝基苯肼、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UMC5斬拌機(jī) 德國(guó)Stephan公司；TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)FTC公司；ColorQuest XE-E色差儀 上海信聯(lián)創(chuàng)作電子有限公司；HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LXJ-IIB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司；HB43-S快速水分測(cè)定儀 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SS752-500脫水機(jī) 泰州市通江洗滌機(jī)械廠。

1.3 方法

1.3.1 素肉丸的制備

素肉丸制備的工藝流程為：大豆拉絲蛋白→浸泡→脫水→蒸汽漂燙→斬拌→乳化胚料制備→混合→風(fēng)味調(diào)配→成型→油炸→真空包裝→成品，操作要點(diǎn)如下。

1）選料：挑選黃色、片狀完整的大豆拉絲蛋白原料；2）冷浸：將大豆拉絲蛋白于冷水中浸泡1 h，至無硬芯；3）冷凍：將泡至無硬芯后的大豆拉絲蛋白進(jìn)行脫水，然后放在-20 ℃進(jìn)行冷凍；4）脫水：將冷凍后的大豆拉絲蛋白原料置于室溫下解凍，然后使用脫水機(jī)脫水5 min，去掉大豆拉絲蛋白原料表面的水分；5）蒸汽漂燙：用大小適中的盆盛適量的水，用電磁爐將水燒至煮沸，將濕潤(rùn)的大豆拉絲蛋白置于簾上，將產(chǎn)生豆腥味的濕潤(rùn)大豆拉絲蛋白與過熱蒸汽接觸，通過汽化除去游離的豆腥成分；6）乳化胚料的制備：以大豆拉絲蛋白濕質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入20%面粉、20%變性淀粉和15%大豆分離蛋白，以及適量水和油制作乳化胚料；7）斬拌：將漂燙后的大豆拉絲蛋白用絞肉機(jī)絞碎，充分混合至均勻；8）風(fēng)味調(diào)配：以大豆拉絲蛋白濕質(zhì)量為基準(zhǔn)，向胚料中加入3.17%食鹽、2.2%白糖、2.01%味精、3.90%蔥和3.22%生姜，攪拌均勻；9）成型：將大豆拉絲蛋白混合物手工搓成肉丸，肉丸直徑2 cm；10）油炸：將油加熱至270 ℃，將素肉丸下至鍋里使肉丸熟制；11）真空包裝：將冷卻至室溫的素肉丸用真空袋裝好，進(jìn)行真空包裝。

1.3.2 VTE的制備

首先用粉碎機(jī)將藤茶粉碎，過60 目篩，然后用石油醚進(jìn)行脫脂，脫脂后放入烘箱，40 ℃烘干。稱取10 g脫脂后的藤茶粉末，在料液比1∶40、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度為70 ℃的條件下回流提取1 h。然后將藤茶混合物用真空泵過濾，得到上清液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，凍干得到VTE。以二氫楊梅素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用AlCl3比色法[22]測(cè)得VTE的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.14%。

1.3.3 原料處理與分組

以不添加任何物質(zhì)的素肉丸為空白對(duì)照，其他3 組中，分別在素肉丸中添加素肉丸質(zhì)量的0.01% BHT（陽性對(duì)照）、0.1% VTE粉末、0.3% VTE粉末。然后將4 組樣品裝入透氧袋（乙烯-醋酸乙烯共聚物）中，在（4±1）℃的黑暗條件貯藏8 d，每隔2 d取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

將樣品切成小塊，取3 g樣品放至鋁托盤上，用快速水分測(cè)定儀測(cè)定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 亮度的測(cè)定

采用用色差儀測(cè)定肉丸亮度L*值。

1.3.6 彈性的測(cè)定

將樣品切成2 cmh2 cmh1 cm的小塊，用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品的彈性，測(cè)定參數(shù)：形變量50%，檢測(cè)速率120 mm/min，起始力0.8 N。

1.3.7 素肉丸脂質(zhì)氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.7.1 POV的測(cè)定

參考GB 5009.227ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》的滴定法測(cè)定素肉丸的POV，以過氧化物相當(dāng)于碘的含量表示，單位為g/100 g。

1.3.7.2 TBARS值的測(cè)定

參考GB 5009.181ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》中的分光光度法測(cè)定素肉丸的TBARS值，結(jié)果以每千克素肉丸中所含丙二醛的質(zhì)量表示，單位為mg/kg。

1.3.8 素肉丸蛋白氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.8.1 羰基含量的測(cè)定

參考Oliver等[23]的方法測(cè)定素肉丸的羰基含量，結(jié)果以每毫克蛋白所含羰基物質(zhì)的量表示，單位為nmol/mg。

1.3.8.2 巰基含量的測(cè)定

采用Ellman[24]的方法測(cè)定素肉丸中的巰基含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)，單位為nmol/mg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并用方差分析進(jìn)行最小顯著性差異法多重差異分析，P＜0.05表示差異顯著。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間理化性質(zhì)的影響

2.1.1 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

表 1 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 1 Effect of VTE on moisture content of vegetarian meatballs during refrigerated storage%

如表1所示，所有組的初始水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著差異（P＞0.05）。與冷藏0 d相比，冷藏8 d后所有組的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著下降（P＜0.05），這可能是由于隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品的水分蒸發(fā)。貯藏過程中添加VTE的素肉丸水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明添加VTE可以有效抑制素肉丸的水分蒸發(fā)，保持其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.2L*值的變化

表 2 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間L*值的影響Table 2 Effect of VTE on L* value of vegetarian meatballs during refrigerated storage

顏色在消費(fèi)者對(duì)素肉丸的接受度方面起著重要作用。如表2所示，經(jīng)VTE處理的素肉丸初始L*值顯著低于空白對(duì)照組（P＞0.05），這可能是VTE本身的顏色（綠色）導(dǎo)致的。在冷藏期間，所有組的L*值顯著下降（P＜0.05）。但冷藏8 d時(shí)，經(jīng)VTE處理的素肉丸L*值顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明VTE可以抑制素肉丸在貯藏過程中色澤的劣化。

2.1.3 彈性的變化

如表3所示，冷藏的前2 d內(nèi)，所有組的彈性沒有顯著性差異（P＞0.05）。與貯藏初始（0 d）相比，冷藏8 d后所有組的彈性均顯著下降（P＜0.05），但與空白對(duì)照組相比，經(jīng)VTE處理的素肉丸具有更高的彈性（P＜0.05），甚至高于BHT處理組。說明VTE有利于保持素肉丸貯藏過程中的彈性。

表 3 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間彈性的影響Table 3 Effect of VTE on elasticity of vegetarian meatballs during refrigerated storage

2.2 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化的影響

2.2.1 POV的變化

圖 1 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間POV的影響Fig. 1 Effect of VTE on POV of vegetarian meatballs during refrigerated storage

POV是評(píng)估油脂初始氧化程度的一個(gè)指標(biāo)。如圖1所示，在冷藏0 d時(shí)，空白對(duì)照、0.01% BTH、0.1% VTE、0.3% VTE處理組的初始POV分別為1.84、1.75、1.72、1.64 g/100 g，且0.1% VTE和0.3% VTE處理組的POV顯著低于空白對(duì)照組，說明VTE對(duì)素肉丸在冷藏初期就抑制了脂質(zhì)氧化。當(dāng)冷藏4 d時(shí)，空白對(duì)照組的POV達(dá)到了最大值，隨后開始下降。這可能是由于在冷藏初期，素肉丸發(fā)生脂質(zhì)氧化，在4 d時(shí)初級(jí)氧化結(jié)束；4 d后，形成的氫過氧化物分解成二級(jí)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致POV下降[25]。在冷藏的0～4 d，0.1% VTE和0.3% VTE組POV變化不顯著（P＞0.05）；冷藏4～6 d過程中，POV略有增加。以上說明0.1% VTE和0.3% VTE組素肉丸的初始氧化非常緩慢。在冷藏0～6 d時(shí)，0.1% VTE組和0.3% VTE組的POV顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明VTE可以顯著抑制素肉丸的脂質(zhì)氧化。貯藏8 d后，兩個(gè)VTE組的POV顯著高于空白對(duì)照組，說明VTE組的素肉丸形成的氫過氧化物降解緩慢，進(jìn)一步說明VTE延緩了脂質(zhì)氧化。此外，0.1%、0.3% VTE抑制脂質(zhì)氧化的作用強(qiáng)于0.01% BHT。

2.2.2 TBARS值的變化

如圖2所示，在冷藏0～2 d的過程中，所有組的TBARS值沒有顯著性變化（P＞0.05）。與初始TBARS值相比，冷藏8 d后所有組素肉丸的TBARS值顯著增加（P＜0.05），但在冷藏的第8天，經(jīng)VTE處理的素肉丸的TBARS值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），且VTE和BHT處理組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。有研究表明，與空白對(duì)照組相比，二氫楊梅素和VTE均能顯著降低熟牛肉貯藏過程中的TBARS值[20]。本課題組已通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析了VTE的化學(xué)組成，VTE主要由二氫楊梅素和少量的二氫槲皮素組成[26]。因此，VTE能顯著抑制素肉丸在冷藏期間發(fā)生的脂質(zhì)氧化是合理的。

圖 2 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間TBARS值的影響Fig. 2 Effect of VTE on TBARS value of vegetarian meatballs during refrigerated storage

2.2.3 羰基含量的變化

圖 3 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間羰基含量的影響Fig. 3 Effect of VTE on carbonyl content of vegetarian meatballs during refrigerated storage

除了脂質(zhì)氧化之外，蛋白質(zhì)氧化是食品劣化的另一個(gè)主要原因，可通過測(cè)定所形成的羰基的量來評(píng)估蛋白質(zhì)氧化的程度[27-28]。如圖3所示，在冷藏期間，所有組素肉丸的羰基含量均顯著增加（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組、0.01% BHT、0.1% VTE和0.3% VTE組的初始羰基含量分別為1.76、1.62、1.58 nmol/mg和1.51 nmol/mg。因此，在冷藏剛開始時(shí)，0.3% VTE就可以顯著抑制蛋白質(zhì)的初始氧化（P＜0.05）。經(jīng)VTE處理的素肉丸在整個(gè)冷藏期間的羰基含量均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明VTE可以顯著抑制素肉丸貯藏過程中羰基化合物的形成，其抑制作用甚至高于0.01% BHT。冷藏結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組、0.01% BHT、0.1% VTE和0.3% VTE組的羰基含量分別為3.39、2.91、2.75 nmol/mg和2.42 nmol/mg，與先前的報(bào)道證明天然抗氧化劑，如水果提取物中的酚類化合物可以顯著抑制羰基化合物的形成[29]結(jié)果類似。

2.2.4 巰基含量的變化

圖 4 VTE對(duì)素肉丸在冷藏期間巰基含量的影響Fig. 4 Effect of VTE on sulfhydryl content of vegetarian meatballs during refrigerated storage

蛋白質(zhì)氧化還與巰基的喪失有關(guān)，半胱氨酸硫醇基團(tuán)的氧化可以促進(jìn)分子間二硫鍵的形成，導(dǎo)致巰基含量減少[6]。因此，巰基含量是廣泛用于衡量蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)之一。如圖4所示，在冷藏期間，所有組素肉丸的巰基含量均顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)VTE處理的素肉丸在整個(gè)冷藏期間的巰基含量均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明VTE的加入加速了巰基的損失，與Xu Liang等[30]的研究結(jié)果一致。此外，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即在混合豬肉餅中加入VTE也會(huì)加速巰基的損失[26]?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)巰基與酚類化合物之間發(fā)生了相互作用，鄰位酚結(jié)構(gòu)容易與親核巰基形成共價(jià)鍵，形成巰基-肟加合物，導(dǎo)致巰基損失。

3 討 論

VTE可以有效抑制素肉丸在冷藏期間發(fā)生的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化，這可能是由于VTE中含有豐富的二氫楊梅素。本實(shí)驗(yàn)以二氫楊梅素為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定發(fā)現(xiàn)VTE含有較高的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為8.14%。二氫楊梅素可以顯著抑制肉制品在冷藏期間的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%二氫楊梅素抑制作用比質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%丁基羥基茴香醚更強(qiáng)[20]。黃酮類化合物作為一種抗氧化植物酚類，它們的抗脂質(zhì)氧化機(jī)制主要?dú)w因于它們具有清除自由基或螯合金屬的能力[31]。酚通過向自由基提供氫原子，自身被氧化成苯氧基，苯氧基是一種相當(dāng)穩(wěn)定的自由基，可以抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，從而防止脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的進(jìn)一步氧化[32]。但VTE與仿肉產(chǎn)品氧化的確切作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探索。

二氫楊梅素是VTE的主要成分，本實(shí)驗(yàn)證明了VTE可有效抑制素肉丸在冷藏期間TBARS值的增加和羰基化合物的形成。雖然本實(shí)驗(yàn)沒有比較VTE和二氫楊梅素對(duì)素肉丸貯藏過程中品質(zhì)影響的差別，但先前的研究表明二氫楊梅素在防止豆油氧化方面比VTE更有效，但VTE和二氫楊梅素在降低煮熟的牛肉TBARS值方面沒有顯著差異[20]。在該實(shí)驗(yàn)中，沒有研究VTE和二氫楊梅素保存素肉丸的原因是因?yàn)槎錀蠲匪氐奶崛∵^程更復(fù)雜且成本更高。因此，與二氫楊梅素相比，VTE對(duì)混合豬肉餅的抗氧化作用的研究具有較高的實(shí)際意義。

與空白對(duì)照組相比，0.1%、0.3% VTE可以更好地保持素肉丸貯藏過程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、L*值及彈性（P＜0.05）；顯著抑制素肉丸POV和TBARS值的增加，當(dāng)冷藏8 d時(shí)，其抑制作用與0.01% BHT沒有顯著性差異（P＞0.05）；顯著抑制素肉丸中羰基化合物的形成（P＜0.05），其抑制效果好于0.01% BHT，并呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。因此，VTE對(duì)于素肉丸保藏具有實(shí)際意義，可抑制其變質(zhì)，從而延長(zhǎng)保質(zhì)期。