藏羊肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27對肌原纖維蛋白及細胞凋亡酶的影響

孫金龍，師希雄*，黃 峰，韓 玲，陳 騁，岳建偉

（甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

藏羊是我國原始綿羊品種之一，分布廣泛，在家畜中所占比重較大[1]。歐拉藏羊是藏羊的主要品種之一，主要生長在甘肅、青海、西藏等青藏高原的高海拔地區(qū)，特殊的生長環(huán)境造就了歐拉藏羊耐高寒、個體高大和生長較快速的特點[2]。并且歐拉藏羊肉味道鮮美、風味獨特，具有良好的營養(yǎng)和食用品質[3]。但粗放的飼養(yǎng)方式同時也導致歐拉藏羊肉的纖維較粗，使得其肉嫩度較差，嚴重制約了肉品加工領域對歐拉藏羊肉的開發(fā)和利用。因此，改善歐拉藏羊肉嫩度、提高其食用品質，對歐拉藏羊肉的生產加工具有重要意義。

成熟是肌肉在宰后發(fā)生的重要生理性變化，在此過程中，肌肉的嫩度、色澤、保水性和風味均會得到改善[4]。其中，成熟過程對肌肉嫩度的影響最大。國內外研究報道指出，宰后成熟嫩化主要歸因于內源性蛋白酶對肌原纖維蛋白的有限降解[5-7]。肉中肌原纖維蛋白的降解破壞了肌纖維結構，在很大程度上改善了肉的嫩度，進而提高了肌肉的食用品質[8]。但是，目前肉的成熟嫩化機理尚未明確。動物屠宰后，缺血、缺氧的應激狀態(tài)不僅打破了肌肉的生理平衡，同時也刺激了小分子熱休克蛋白的表達。熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）是小分子熱休克蛋白的一種，經(jīng)常被用于小分子熱休克蛋白對細胞凋亡的相關研究。

至今，哺乳動物中鑒別出數(shù)十種小分子熱休克蛋白，它們普遍存在且在特殊組織內表達[9]。Hsp20、Hsp27和αβ-結晶蛋白等小分子熱休克蛋白的表達水平均高于骨骼肌中其他蛋白質，被認為是心肌肌肉嫩化的潛在因素[10]。

Morzel等報道Hsp27可維持肌原纖維的穩(wěn)定性，其表達量與牛肉的韌性呈負相關[11]。安格斯牛背最長肌中Hsp27表達量的下降有利于肌球蛋白和肌動蛋白的水解，進而提高了肌肉嫩度；且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低[12]。然而，蛋白質組學的研究結果中Hsp27和嫩度的關系并不一致。Contreras-Castillo等指出，肌原纖維結合的小分子熱休克蛋白可以作為μ-鈣激活酶替代基質，并導致了肉的嫩化[13]。Hsp27與Caspase-3氨基末端的肽相互作用，為細胞凋亡效應酶提供了一種新的調控機制[14]。以上研究指出，Hsp27可能通過影響μ-鈣激活酶和Caspase-3在心肌成熟過程中降低肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，但其具體機制仍需進一步探究。

總之，Hsp27對肌原纖維蛋白和細胞凋亡酶的影響研究結果不一致。目前，關于歐拉藏羊肉宰后成熟過程中Hsp27的作用鮮有報道。因此，本實驗利用Hsp27的抑制劑（KRIBB3）對歐拉藏羊背最長肌進行處理，在相應時間點取樣，并對肌原纖維蛋白的降解特性和細胞凋亡酶活力進行測定，探討Hsp27對肌原纖維蛋白降解及細胞凋亡酶活力的影響，以闡明Hsp27對羊肉的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3～4 歲的歐拉藏羊6 只，體質量相近，生理成熟度等指標基本相似，采自甘南安多畜牧有限公司。參考國內外對動物福利的相關要求，屠宰方式嚴格按照國內標準操作進行，宰前保證藏羊健康狀況良好，宰后熱應激波動幅度較小，跟腱吊掛，從半胴體上取下整條背最長肌作為實驗材料。

Caspase-3、Caspase-9酶活力試劑盒 北京麥瑞博生物科技有限公司；Hsp27抑制劑（KRIBB3）、Csapase-3重組蛋白、μ-鈣激活酶（活力6 000 U）英國Abcam公司；蛋白Marker、Hsp27標準品、蛋白一抗、二抗 北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FA2004B電子天平 上海佑科儀器有限公司；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；iMark全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司；XHF-D內切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；WH-600-LCD型電泳儀 北京市六一儀器廠；脫色搖床 海門其林貝爾儀器制造公司；凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司；-80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

在屠宰后0.5 h內取下背最長肌，剔除脂肪和結締組織膜，將0 d和體外模擬實驗的樣品切成5 g大小，用錫箔紙包裹迅速裝入液氮中運回實驗室，轉入-80 ℃冰箱保存。實驗組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋，按固液比1∶2注入提前準備好的30 mmol/L KRIBB3溶液，4 ℃下快速運回實驗室并在4 ℃冰箱成熟，分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣，并轉移到-80 ℃冰箱保存。對照組樣品切成0.5 cm厚、大小均勻的薄片裝入自封袋中，存放在干冰中快速運回實驗室轉移到4 ℃冰箱成熟，分別在成熟0.5、1、3、5 d時取樣，并測定Caspase-3、Caspase-9的活力以及免疫印跡等指標，待測樣品轉移到-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 體外實驗

參考Ding Zhenjiang等的方法，略有改動[15]。取提取純化后的肌原纖維蛋白（0.5 g）7 份，編號為1～7，以加入10 μg蒸餾水的1號樣作為空白對照，2號樣加入10 μg Caspase-3處理，3號樣加入10 μg Caspase-3和6 μg Hsp27處理，4號樣加入10 μg μ-鈣激活酶處理，5號樣加入10 μg μ-鈣激活酶和6 μg Hsp27處理，6號樣用6 μg Hsp27處理，7號樣用10 μL 0.01 mol/L鈣離子處理，1～7號樣均在30 ℃下孵育2 h。對肌原纖維蛋白特性進行免疫印跡分析。

1.3.3 Caspase-3、Caspase-9活力測定

參考孫志昶等測定細胞凋亡酶活力的方法[16]。采用試劑盒測定Caspase-3、Caspase-9活力。準確稱取待測肉樣10 mg，加入150 μL裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿30 次。然后把勻漿液轉移到1.5 mL離心管中，冰浴5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，把上清液轉移到預冷好的離心管中，在冰中保存待用。分別取Caspase-3、Caspase-9的檢測緩沖液40 μL、待測樣品50 μL，適當混勻后，分別加入Caspase-3、Caspase-9底物Ac-DEVD-pNA、Ac-LEHD-pNA 10 μL，混勻后，在37 ℃下孵育2 h。待顏色發(fā)生明顯變化后測定其A405nm，通過標準曲線計算活力。

1.3.4 MFI測定

肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）測定參考賈青的方法并稍作改進[17]。準確稱取待測肉樣1 g，放入離心管中，加入10 mL MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、20 mmol/L K3PO4），用勻漿機100 000 r/min冰浴勻漿30 s，1 000hg離心15 min。棄去上清液，加入8 mL MFI緩沖液，100 000 r/min冰浴勻漿15 s，1 000hg離心15 min。棄去上清液，再加入10 mL MFI緩沖液，置于均質機上振蕩，將上述溶液倒入200 目篩，過濾沉淀，利用雙縮脲法測定肌原纖維提取液內蛋白質量濃度，再用MFI緩沖液調整肌原纖維提取液蛋白質量濃度至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度，每個樣品重復3 次。將平均值代入公式（1）計算MFI。

1.3.5 肌原纖維蛋白提取及質量濃度的測定

肌原纖維蛋白的提取采用Xia Xiufang等的方法并加以改進[18]。準確稱取1 g肉樣，加入10 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.80），13 000 r/min勻漿10 s，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，沉淀用8 倍體積920 mmol/L磷酸鉀緩沖液溶解后，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，重復兩次。沉淀用8 倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃、1 000hg離心10 min，棄上清液，重復兩次。沉淀中加4 mL 25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25），用雙縮脈法測定肌原纖維蛋白質量濃度，用牛血清白蛋白做標準曲線。

1.3.6 肌原纖維蛋白溶解性測定

肌原纖維蛋白溶解性的測定參考Agyare等的方法并加以改進[19]。按1.3.5節(jié)方法提取肌原纖維蛋白并測定其質量濃度。準確稱取肌原纖維蛋白1 g，溶于50 mL質量分數(shù)為0.75%的氯化鈉溶液中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L的鹽酸溶液調節(jié)至pH 5.5，并在60 ℃水浴鍋中水浴加熱30 min，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取上清液，采用雙縮脲法測定離心前后上清液中肌原纖維蛋白質量濃度，按式（2）計算肌原纖維蛋白溶解性。

1.3.7 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和免疫印跡分析

參考黃峰[20]的方法，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳使用質量分數(shù)4%濃縮膠，肌間線蛋白分離膠質量分數(shù)為10%，肌鈣蛋白-T分離膠質量分數(shù)為12.5%。采用濕法轉印將膠上的蛋白轉到膜上，轉印液含有20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、體積分數(shù)15%甲醇溶液。轉印條件為恒流200 mA，時間90 min。轉印后的聚偏二佛乙烯膜膜用含質量分數(shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液（500 mmol/L NaCl、質量分數(shù)0.05% Tween 20、30 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）室溫封閉1 h。與一抗在4 ℃下反應過夜，然后用TBST溶液漂洗3 次，每次10 min，以去除未結合的一抗。然后把膜放入二抗中在室溫、避光條件下反應60 min。在TBST溶液中漂洗3 次，每次10 min。使用ECL發(fā)光試劑盒在暗室中壓片、曝光。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本實驗的材料均進行3 組平行處理，用Origin 8.5軟件繪制柱狀圖，并用SPSS Statistics 20.0軟件進行誤差分析，用Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 藏羊肉宰后成熟過程中Caspase-3、Caspase-9活力變化

圖 1 Hsp27抑制劑對Caspase-3（A）、Caspase-9（B）活力的影響Fig. 1 Effect of Hsp27 inhibitor on caspase-3 (A) and caspase-9 (B) activity

由圖1A可知，對照組中Caspase-3活力隨著成熟時間的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0～0.5 d時，Caspase-3活力顯著升高（P＜0.05）；在0.5 d時其活力達到最大值；0.5 d后其活力迅速降低。同時，在0.5～3 d內，實驗組Caspase-3活力極顯著高于對照組（P＜0.01）。本研究結果表明，Hsp27抑制劑處理后，藏羊肉中Caspase-3的活力顯著升高，可能由于Hsp27通過調節(jié)細胞色素c的釋放，能間接抑制Caspase-3的激活。此外，Voss等的研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可以與Caspase-3的部分區(qū)域相互作用，并抑制Caspase-3激活所必需的部分位點[14]。由圖1B可知，Caspase-9活力隨著成熟時間的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0～0.5 d時，Caspase-9活力顯著升高（P＜0.05）；在0.5 d時，其活力達到最大值；0.5 d后其活力緩慢降低。同時，在0.5～3 d內，對照組Caspase-9活力極顯著低于實驗組（P＜0.01）。Kemp等在宰后豬肉背肌中檢測到了Caspase-3的原激活片段，并發(fā)現(xiàn)其活力約在宰后2 h達到最大值[21]；Samejima等研究發(fā)現(xiàn)，宰后豬肉在成熟過程中Caspase-3出現(xiàn)酶活力值高峰[22]；賈青研究發(fā)現(xiàn)，宰后12 h，牛背最長肌Caspase-3活力達到最高之后出現(xiàn)顯著下降[17]。以上研究結果與本研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3活力在0.5 d時達到最大值的結果基本一致。Huang Ming等研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3在肌肉蛋白降解中有積極作用[23]。本研究結果表明，Hsp27抑制劑能夠明顯抑制Caspase-3、Caspase-9活力，進而抑制肌原纖維蛋白降解，提示Hsp27能夠通過抑制蛋白質降解從而達到維持蛋白質結構穩(wěn)定性的作用。這與Ding Zhenjiang等[15]發(fā)現(xiàn)Hsp27重組蛋白能夠抑制Caspase-3活力及肌原纖維蛋白降解，以及郭有鋒等[24]發(fā)現(xiàn)熱耐受后Hsp27的聚集可顯著減輕缺血損害導致的細胞凋亡的結果一致。Rane研究發(fā)現(xiàn)Hsp27可通過調控Caspase-9活力抑制細胞凋亡[25]，這也與本研究中Hsp27抑制劑促進Caspase-9活力的結果一致。

2.2 藏羊肉宰后成熟過程中MFI的變化

圖 2 Hsp27抑制劑對MFI的影響Fig. 2 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar fragmentation index

Huff-Lonergan等發(fā)現(xiàn)宰后肌原纖維蛋白降解與肌纖維小片化是成熟嫩化的重要因素[26]。由圖2可知，MFI隨著成熟時間的延長整體呈上升趨勢。0～0.5 d時MFI變化較??；0.5 d時，實驗組和對照組存在顯著差異（P＜0.05）；0.5 d后，實驗組和對照組差異極顯著（P＜0.01）。表明Hsp27抑制劑能夠促進成熟過程中蛋白的降解，促使MFI增加。同時，反映出Hsp27可以抑制肌原纖維小片化的發(fā)生。這與Noguchi等隨著細胞凋亡程度的加深，肌原纖維小片化程度加劇的研究結果基本一致[27]。

2.3 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白溶解性的變化

圖 3 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig. 3 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein solubility

由圖3可知，隨著成熟時間的延長肌原纖維蛋白溶解性增加。但在成熟0.5 d和1 d時，實驗組樣品的肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著；0 d和0.5 d時，對照組樣品肌原纖維蛋白溶解性差異不顯著。實驗組樣品在成熟0.5 d后肌原纖維蛋白溶解性極顯著高于對照組（P＜0.01），這可能是由于Hsp27抑制劑促進了Caspase-3、Caspase-9的活力，進而加速了細胞凋亡，側面反映出Hsp27能夠維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，抑制細胞凋亡發(fā)生。

2.4 藏羊肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白變化

圖 4 Hsp27抑制劑對肌原纖維蛋白降解的影響Fig. 4 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein degradation

由圖4可知，隨著成熟時間的延長，肌原纖維蛋白中的肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T免疫印跡條帶明顯變淺，表明Hsp27抑制劑的添加促進了肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，提示Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。這與Ding Zhenjiang等[15]的研究結果一致；同時，也與Lomiwes等[10]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白能夠在外源αβ-晶狀體蛋白與μ-鈣激活酶作用下維持肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的結果基本一致。肌原纖維的降解在宏觀表現(xiàn)為肉嫩度改善、汁液增多、風味改善等，Bernard等研究發(fā)現(xiàn)Hsp27在夏洛萊牛胸部肌肉中表達量的下調能夠改善肉的嫩度、多汁性和風味[28]。Balan等[29]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)Hsp27降解，且與肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解顯著相關，并推測降解后的Hsp27喪失了其對肌原纖維蛋白的保護功能，從而提高肌原纖維蛋白的水解，這與本實驗結果一致。

2.5 Hsp27對肌原纖維蛋白的體外降解

由圖5可知，2、4號樣品條帶明顯比1號樣品淡，表明Caspase-3和μ-鈣激活酶均能使肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白降解；比較2號樣品與3號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制Caspase-3對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；比較4號樣品與5號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠抑制μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；比較1號樣品與5號樣品，發(fā)現(xiàn)Hsp27能夠維持肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的穩(wěn)定性；比較1號樣品與7號樣品，發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠促進肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解；與1號樣品比較，6號樣品條帶更寬、顏色更深，表明Hsp27能夠抑制肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解。綜上所述，Hsp27的添加抑制了Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解。這與Lomiwes等發(fā)現(xiàn)Hsp27在肉中表達量的下降有利于肌動蛋白與肌球蛋白的水解，進而導致肉嫩度增加，且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低的研究結果一致[10]。Morzel[11]和Ding Zhenjiang[15]等研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27可維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，抑制其降解，并且其表達量與牛肉的韌性呈負相關；Della等[30]研究表明，小分子熱休克蛋白可以保護肌鈣蛋白-T免受降解，其表達與嫩度呈負相關。這與本實驗研究中Hsp27抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解的結果一致。

圖 5 體外肌原纖維蛋白降解變化Fig. 5 In vitro changes in myofibrillar protein degradation

3 結 論

Hsp27能夠抑制Caspase-3和μ-鈣激活酶對肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解；同時，Hsp27通過影響Caspase-3和Caspase-9的活力來參與宰后成熟過程。Hsp27能夠通過抑制Caspase-3和Caspase-9的活力來抑制肌原纖維小片化的發(fā)生以及肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，從而保持了肌原纖維的完整性，抑制了肌肉在宰后成熟過程中的嫩化。