紅曲霉對類Camembert干酪成熟期質(zhì)構(gòu)和風味的影響

王 童，逄曉陽，蘆 晶，馬長路，楊寶雨，吳 政，梁佳祺，張書文*，呂加平*

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100093）

霉菌干酪在成熟過程中發(fā)生的一系列酶促反應和化學變化對干酪的質(zhì)構(gòu)和風味會產(chǎn)生重要的影響。目前，商品霉菌干酪加工過程中使用的霉菌菌種主要有卡地干酪青霉（Penicilliumcamemberti）、婁地青霉（P.roqueforti）和白地霉（Geotrichum candidum），這些菌種可以通過商業(yè)渠道購買獲得[1]。霉菌干酪包括表面霉菌成熟型和內(nèi)部霉菌成熟型，表面霉菌成熟型干酪（如Camembert干酪、Brie干酪）的特征是成熟后其表面覆蓋一層霉菌，外表稍硬，內(nèi)部質(zhì)地柔軟；內(nèi)部霉菌成熟型干酪（如藍紋干酪等）在生產(chǎn)過程中需要穿孔，以利于空氣進入凝乳中，帶入霉菌的孢子，成熟后干酪內(nèi)部會形成有色的霉紋。近幾年來，Camembert干酪因成熟期短、酶解程度高、功能性強而備受關(guān)注。

關(guān)于霉菌干酪，國內(nèi)外已有大量的研究，主要集中于成熟過程中干酪的理化和風味變化以及這些變化與干酪發(fā)酵的乳酸菌、酵母和霉菌發(fā)酵劑之間的關(guān)系，研究人員希望通過了解干酪成熟的機理，從而篩選出有益于干酪成熟和功能性的發(fā)酵菌種。Kawai等研究了從不同國家的Camembert干酪、Brie干酪、Coulommiers干酪和Chaource干酪中篩選的6 株白地霉，對菌株所產(chǎn)香氣進行比較，并對單菌種生產(chǎn)的表面霉菌成熟干酪產(chǎn)品進行感官比較，最終認為來自法國Camembert干酪的白地霉獲得的結(jié)果最滿意[2]；Leclercq-Perlat等研究了Camembert干酪成熟期理化性質(zhì)、風味物質(zhì)和微生物菌群的，并將這些指標建立一定的聯(lián)系[3]；Voigt等研究了高壓處理牛乳對Camembert干酪成熟期品質(zhì)的影響[4]；Lee等將韓國傳統(tǒng)的紅參粉加入Camembert干酪中以改善其功能特性[5]。劉南從傳統(tǒng)腐乳中分離出的毛霉應用于Camembert干酪的生產(chǎn)[6]；Chen Lishui等從129 株酵母中篩選出3 株有潛在益生功能的菌株應用于Camembert干酪的生產(chǎn)[7]；Yu Huaning等將紅曲霉應用于Camembert干酪中制備紅曲干酪[8]。這些研究已取得一定進展，但對成熟過程中干酪質(zhì)構(gòu)和風味的變化規(guī)律還有待進一步研究。

紅曲霉在食品中的應用已有上千年的歷史，主要用于腐乳、紅曲米（粉）、紅曲酒和紅曲醋等傳統(tǒng)食品，紅曲類產(chǎn)品因其天然的紅色色澤以及特有的風味而廣受中國消費者歡迎。許多研究結(jié)果還表明，紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中含有多種生物活性物質(zhì)，如莫納卡琳K、γ-氨基丁酸、紅曲色素和紅曲多糖等，所以紅曲霉發(fā)酵食品在食品工業(yè)中被廣泛用作著色劑、防腐劑、營養(yǎng)補充劑，其還可用于醫(yī)藥行業(yè)作為膳食補充劑，在預防治療高血壓、降低膽固醇水平、改善血液循環(huán)系統(tǒng)等方面都有很好的效果[9-11]。因此，應用來源于腐乳中的紅曲霉作為輔助發(fā)酵劑改善類Camembert干酪的風味和品質(zhì)，不僅能夠豐富我國天然干酪的品種，提高我國消費者對干酪接受度，而且對我國天然干酪開發(fā)具有重要意義。

本實驗以生牛乳為原料，以霉菌干酪的加工工藝為基礎，通過添加或不添加紅曲霉分別制作兩種不同的類Camembert干酪，在兩種酪成熟期的第0、8、16、24、32、40天分別進行取樣，通過水分質(zhì)量分數(shù)、蛋白水解度、質(zhì)構(gòu)和風味參數(shù)，對比分析在40 d的成熟期兩種干酪質(zhì)構(gòu)和風味的變化以及紅曲霉對類Camembert干酪成熟期質(zhì)構(gòu)和風味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳購于北京市三元綠荷牧場；FD-DVS R-704-乳酸菌發(fā)酵劑、CHY-MAX POWDER EXTRA NB凝乳酶科漢森中國有限公司；CHOOZITTMPC 12 LYO 20D卡地干酪青霉 丹尼斯克中國有限公司；紅曲霉菌種（保藏號5038，菌種來源為腐乳）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YQ1-57乳成分體細胞檢測儀、BSA124S-CW型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；PEN-3型便攜式電子鼻 德國Airsense公司；QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏試驗設備有限公司；HDL超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LHS150/250 HC-II恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；干酪槽、干酪刀、干酪板、模具等為自制。

1.3 方法

1.3.1 原料乳品質(zhì)檢測

采用乳成分體細胞檢測儀以對牛乳中的蛋白、脂肪、乳糖水平及體細胞數(shù)進行檢測，酸度測定采用GB 5009.239ü2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》中的方法；菌落總數(shù)測定采用GB 4789.2ü2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中的方法。

1.3.2 霉菌干酪加工工藝

原料牛乳→標準化→殺菌（75 ℃、15 s）→冷卻（32 ℃）→接種乳酸菌發(fā)酵劑（1.5 g/100 L）→添加霉菌發(fā)酵劑（106CFU/L）、紅曲霉發(fā)酵液（白霉干酪不添加紅曲霉發(fā)酵液）（體積分數(shù)3%）→發(fā)酵1 h（34 ℃）→加凝乳酶（40 IMCU/L）→切割→攪拌→入模排乳清→表面鹽漬（涂抹質(zhì)量分數(shù)1%的食鹽，16～18 ℃鹽漬2 h）→成熟12 d（12～14 ℃、相對濕度95%）→蠟紙包裝→4 ℃存放后熟28 d

根據(jù)以上方法，制得兩種干酪，僅接種卡地青霉制得白霉干酪、接種卡地青霉和紅曲霉制得紅曲干酪。兩種干酪的成熟期均為40 d，在成熟期的第0、8、16、24、32、40天分別對干酪進行取樣，探究其質(zhì)構(gòu)和風味隨成熟時間的變化。

1.3.3 紅曲霉發(fā)酵液制備

將紅曲霉在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，用無菌水洗滌收集孢子得到濃度為1.0h105CFU/mL的孢子液，以體積分數(shù)5%的接種量接種到已滅菌質(zhì)量分數(shù)5%馬鈴薯全粉溶液中，30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d，得到色值40 U/mL的紅曲霉發(fā)酵液。

1.3.4 干酪水分測定

采用GB 5009.3ü2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中對半固體樣品的測定方法。

1.3.5 干酪蛋白水解度測定

蛋白質(zhì)水解的測定參照Chen Lishui等[7]的方法，pH 4.6酸溶性氮（acid soluble nitrogen，ASN）的測定：準確稱取0.75 g干酪樣品，加入25 mL pH 4.6的醋酸鹽緩沖溶液，充分研磨，制成懸浮液。懸浮液于4 000 r/min離心20 min，準確量取5 mL上清液移入凱氏消化管中，進行凱氏定量測定，計算ASN占干酪總氮（total nitrogen，TN）的比例（ASN/TN）。非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）的測定：準確稱取1.50 g干酪樣品，加入25 mL質(zhì)量分數(shù)12%的三氯乙酸溶液，充分研磨，制成懸浮液。懸浮液于4 000 r/min離心20 min，準確量取5 mL上清液移入凱氏消化管中，進行凱氏定量測定，計算NPN占干酪總氮的比例（NPN/TN）。每個樣品做3 次平行。

1.3.6 干酪質(zhì)構(gòu)的測定

質(zhì)構(gòu)的測定參考Innocente等[12]的方法，將干酪切割為20 mmh20 mmh20 mm的立方體，在室溫（（25f2）℃）下平衡1 h后進行質(zhì)構(gòu)測試。干酪質(zhì)構(gòu)采用質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）二次下壓法測定，具體測試參數(shù)：測試前探頭行進速率為1 mm/s，測試中探頭行進速率為1 mm/s，探頭回程的行進速率為5 mm/s，采用應變測試模式，壓縮比為75%；兩次壓縮間隔時間為5 s；觸發(fā)力為5.0 g；探頭為p/5；數(shù)據(jù)獲取率為200 pulses/s；每個樣品至少平行測試3 次。干酪的硬度、黏著性、內(nèi)聚性、彈性、膠性以及咀嚼性等質(zhì)構(gòu)參數(shù)采用質(zhì)構(gòu)儀自帶的軟件Exponent 5.0進行處理獲取。

1.3.7 電子鼻測定風味的變化

參考Kalit等[13]的方法并進行適當修改，即精確稱取每份質(zhì)量為（2.00f0.01）g樣品，切碎后分別裝入20 mL頂空瓶中，在室溫下平衡20 min，充分產(chǎn)生頂空揮發(fā)氣體。樣品密封，通過頂空抽樣方式檢測，每個樣品做3 次平行。采用PEN-3型便攜式電子鼻進行測定，電子鼻傳感器陣列包括10 個高靈敏度加熱型金屬氧化物檢測器傳感器，載氣為干燥空氣，流速為300 mL/min，清洗時間為180 s，樣品測試時間為60 s，通過軟件記錄每秒的響應值，每個樣品信息圖共有10 條曲線，選取傳感器相應信號曲線平穩(wěn)處4 個響應值作為樣品信息采集點，得到原始數(shù)據(jù)，然后用Winmuster 1.6.2軟件進行主成分分析。

1.3.8 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定風味物質(zhì)

樣品前處理：參考Lee等[14]的方法，每個樣品分別稱?。?.00f0.01）g，將塊狀樣品切碎后放入特制的頂空瓶中，迅速蓋上蓋子，在60 ℃水浴中平衡30 min。將已老化的固相微萃取頭（聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS），100 μm）從瓶蓋中插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭推出暴露于頂空的氣體中進行萃取吸附30 min，然后將纖維頭退回到萃取頭內(nèi)，拔出萃取頭。將萃取吸附了頂空氣體組分的萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進樣器中，測得定性結(jié)果。

色譜和質(zhì)譜條件。色譜條件：色譜柱為DB-WAX彈性石英毛細管柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速0.8 mL/min，恒速；多階段程序升溫，起始溫度40 ℃，保持30 min，以6 ℃/min升溫至130 ℃，再以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min，進樣口溫度為250 ℃，不分流。質(zhì)譜條件：正離子電子轟擊，發(fā)射電流為200 μA，電子能為70 eV，接口溫度為250 ℃，源溫度為200 ℃，檢測電壓為350 V。

1.3.9 揮發(fā)物的定性及定量測定

定性測定：將揮發(fā)物質(zhì)譜圖與NIST標準譜庫進行匹配，僅報道正、反匹配度大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果。揮發(fā)物的保留指數(shù)（retention index，RI）通過化合物與兩種緊靠它的作為標準物的正構(gòu)烷烴來標定，設其中一個碳原子數(shù)為n，計算公式如公式（1）。

式中：tR（n）、tR（n+1）、tR（x）分別為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴、碳原子數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴、揮發(fā)物的保留時間。

定量測定：將1 μL含量為890 mg/g的內(nèi)標物四氫呋喃加入5 g樣品中，通過計算待測揮發(fā)物與內(nèi)標物的峰面積比求得待測揮發(fā)物含量（假定各揮發(fā)物的絕對校正因子為1.0），計算如式（2）所示。

式中：A待測揮發(fā)物/A內(nèi)標物為待測揮發(fā)物與內(nèi)標物的峰面積比；m內(nèi)標物為內(nèi)標物質(zhì)量（1 μg）；m樣品為樣品質(zhì)量（5 g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

響應質(zhì)構(gòu)參數(shù)和風味物質(zhì)參數(shù)的方差分析由SPSS 24.0軟件完成，顯著性分析采用單因素方差分析中的最小顯著性差異法進行，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料乳品質(zhì)分析結(jié)果

表 1 原料乳成分及新鮮度測定結(jié)果Table 1 Composition and freshness of raw milk

查閱GB 19301ü2010《食品安全國家標準 生乳》，該原料乳成分及新鮮度符合該標準的要求，可用于干酪加工。

2.2 兩種干酪成熟期水分質(zhì)量分數(shù)和蛋白水解度分析結(jié)果

圖 1 兩種干酪不同成熟時間的水分質(zhì)量分數(shù)的變化Fig. 1 Changes in water content of two cheeses with ripening time

圖 2 兩種干酪不同成熟時間的ASN/TN的變化Fig. 2 Changes in acid soluble nitrogen to total nitrogen ratio of two cheeses with ripening time

圖 3 兩種干酪不同成熟時間的NPN/TN的變化Fig. 3 Changes in non-protein nitrogen to total nitrogen ratio of two cheeses with ripening time

由圖1可知，在成熟期間兩種干酪的水分質(zhì)量分數(shù)都在不斷降低，且前16 d下降速率較快，16 d后用蠟紙包裝干酪并放入4 ℃冰箱成熟保存，水分質(zhì)量分數(shù)僅有少量降低。干酪在剛脫離模具時，水分質(zhì)量分數(shù)較高，其內(nèi)部還有少部分乳清沒有完全排出，在表面進行鹽漬后，表面滲透壓較高，也促進內(nèi)部的殘余乳清在表面析出，在成熟期的前2 d，培養(yǎng)箱相對濕度設定為80%～85%，使干酪表面逐漸干燥，從而有益于霉菌孢子的快速生長。由圖1可知，加入紅曲霉發(fā)酵液后干酪的水分質(zhì)量分數(shù)有一定的提高，這是因為紅曲霉在發(fā)酵液中分解淀粉產(chǎn)生大量的糖類物質(zhì)，而糖類物質(zhì)大多具有很強的吸水性，故紅曲干酪的水分質(zhì)量分數(shù)高于白霉干酪。

蛋白水解對于干酪成熟期質(zhì)地和風味有著重要作用，因此，蛋白水解程度被認為是干酪成熟的一個指標。一般來說，蛋白水解指數(shù)通常用pH 4.6 ASN和NPN占干酪TN的比例來表示。干酪中蛋白的水解主要由發(fā)酵劑中微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶、牛乳自身微生物產(chǎn)生的蛋白酶以及干酪中殘余的凝乳酶催化進行的。ASN/TN是蛋白初級水解的指標，pH 4.6環(huán)境下的ASN主要由干酪內(nèi)部殘余的凝乳酶催化蛋白水解產(chǎn)生的，也有部分來源于微生物產(chǎn)生的蛋白酶催化產(chǎn)生；NPN/TN是蛋白次級水解的指標，NPN含量與干酪中的霉菌和細菌產(chǎn)生的蛋白酶有關(guān)[15]。由圖2、3可知，隨著成熟時間的延長，兩種干酪的ASN/TN和NPN/TN不斷增加，說明蛋白的初級和次級水解程度都在不斷加劇。成熟初期微生物尤其是霉菌不斷生長產(chǎn)生大量蛋白酶，加速蛋白水解，成熟16 d之后干酪在4 ℃環(huán)境下微生物生長受到一定的抑制，蛋白酶活力也有一定的下降，蛋白水解速率逐漸下降。加入紅曲霉后在一定程度上提高了蛋白的初級和次級水解度，這可能是由于加入的紅曲霉不僅自身可以產(chǎn)生一些蛋白酶促進蛋白水解，而且其發(fā)酵液中含有的糖類氨基酸能營養(yǎng)物質(zhì)也可以促進其他霉菌和細菌的生長。

2.3 兩種干酪成熟期質(zhì)構(gòu)的分析

表 2 兩種干酪成熟期間質(zhì)地特性的變化Table 2 Changes in texture parameters of cheeses during ripening

從表2可知，在干酪剛脫離模具時，紅曲干酪的硬度、彈性、膠性和咀嚼性均小于白霉干酪而黏著性則大于白霉干酪，這是由于紅曲干酪在凝乳前加入了紅曲霉發(fā)酵液，發(fā)酵液中紅曲霉生長到一定階段其菌絲相互纏繞形成球狀，在凝乳過程中對蛋白膠束的形成產(chǎn)生一定的阻礙，使得其初期的硬度、彈性及相關(guān)指標低于白霉干酪。發(fā)酵液中含有大量的淀粉類物質(zhì)，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵淀粉被水解產(chǎn)生一部分糖類，使其黏著性較高。隨著成熟期延長，兩種干酪的硬度在0～8 d不斷增加，8 d后呈下降的趨勢。牛乳的酶凝過程可以分為兩個階段：首先是凝乳酶水解穩(wěn)定酪蛋白結(jié)構(gòu)的κ-酪蛋白，形成副酪蛋白和糖巨肽，當足夠的κ-酪蛋白被水解后，就會發(fā)生非酶二級反應即酪蛋白凝聚；酪蛋白通過凝集形成蛋白質(zhì)三維空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，并通過脫水收縮使結(jié)構(gòu)變得更加致密，形成一定硬度及彈性的干酪粒[16-17]。干酪在剛脫離模具的時候水分質(zhì)量分數(shù)較高，硬度也較小。由水分質(zhì)量分數(shù)結(jié)果可知，在前8 d的成熟期內(nèi)，干酪的水分質(zhì)量分數(shù)降低較快而硬度增加；在成熟期的第6天，開始有白霉在干酪表面生長，再經(jīng)過2～3 d，干酪表面會被一層致密的白色絨毛狀的菌絲包裹，霉菌生長到一定階段會代謝產(chǎn)生蛋白酶使干酪中的酪蛋白膠束發(fā)生水解，蛋白空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)強度和剛度降低，因此其硬度開始減小[18-19]。彈性表征干酪受到外力作用后恢復其原有形狀的能力，干酪的彈性在0～8 d有一定的增加，在成熟期的第8～40天隨成熟時間的延長呈下降趨勢，后期下降速率趨于平緩。引起這一變化的原因是在成熟初期干酪內(nèi)部有較多的孔洞，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整，酪蛋白膠束高度交聯(lián)，使干酪表現(xiàn)出較好的彈性，而伴隨成熟時間的延長，霉菌產(chǎn)生的蛋白酶使部分蛋白水解，孔洞逐漸消失，干酪的彈性也在逐漸下降[20]。黏著性中的負號代表測試探頭受到的作用力方向向下，與大小無關(guān)。從表2中可以看出，兩種干酪黏著性隨成熟時間的延長逐漸增大，因為隨著成熟時間的延長，霉菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶使蛋白質(zhì)不斷水解，大分子分解形成小分子物質(zhì)，二者形成的小分子物質(zhì)不斷融合，發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，導致干酪的黏著性隨著成熟期的延長逐漸增加[15]。

膠性是干酪的整體屬性，咀嚼性表征咀嚼過程中能量的整體消耗，膠性和咀嚼性是二次特性，二者均與硬度成正比，因此變化趨勢和硬度相似，這與于華寧等的實驗結(jié)果一致[16]。成熟初期（0～8 d）膠性和咀嚼性由于水分質(zhì)量分數(shù)減少，硬度增大而增大，隨著成熟期延長，蛋白質(zhì)水解和脂肪降解的程度越來越高，干酪質(zhì)地變得柔軟，其咀嚼性和膠性都呈下降趨勢。回復性表示干酪受壓后迅速恢復形變的能力，隨著成熟時間的延長，酪蛋白水解過程持續(xù)進行，干酪的組織逐漸被破壞，因此回復性呈下降趨勢。

將兩種干酪各項質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)對比分析發(fā)現(xiàn)，在相同的成熟時間，紅曲干酪的硬度、彈性、膠性、咀嚼性和回復性要低于白霉干酪，產(chǎn)生這種差異的原因可能是紅曲霉發(fā)酵液中含有一些淀粉等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)加入牛乳后在干酪凝乳過程對酪蛋白膠束的聚集產(chǎn)生一定阻礙，影響了酪蛋白空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，使孔洞數(shù)量減少，進而造成其硬度、彈性、膠性、咀嚼性和回復性一定程度減小，干酪總體呈現(xiàn)柔軟質(zhì)地。對比兩種干酪的黏著性參數(shù)，在相同的成熟時間，紅曲干酪的黏著性高于白霉干酪，這可能是由于紅曲霉在以馬鈴薯為碳源的培養(yǎng)基中會產(chǎn)生很多的糖化酶，從而分解淀粉產(chǎn)生糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)具有較高的黏性，所以發(fā)酵液加入到干酪中會提高干酪的黏著性，而高黏著性對產(chǎn)品光滑、均勻的質(zhì)地更加有利。因此，與白霉干酪相比，紅曲干酪口感更柔軟、質(zhì)地更加均勻，表現(xiàn)出更優(yōu)良的質(zhì)構(gòu)特性。

2.4 電子鼻分析兩種干酪成熟期的整體風味特性變化

圖 4 兩種干酪不同成熟時間（0～40 d）的電子鼻主成分分析圖Fig. 4 Principal component analysis of electronic nose data for two cheeses with different ripening times (0-40 d)

電子鼻通過模擬人類和動物嗅覺工作原理對檢測氣味進行分析，與其他分析方法不同的是，電子鼻得到的不是樣品中某一種或幾種組分的定性定量結(jié)果，而是能捕捉到樣品中揮發(fā)性成分的整體信息[21]。將電子鼻對兩種干酪在40 d成熟期內(nèi)6 個時間點檢測的風味參數(shù)進行主成分分析，結(jié)果如圖4所示。PC1和PC2貢獻率和為92.33%，大于90%，說明這兩個主成分已經(jīng)代表了樣品的主要信息特征。從圖4中可以看出，白霉干酪風味變化主要在第一主成分軸上，而紅曲干酪風味在第二主成分軸上有較大變化。從成熟期的變化來看，白霉干酪和紅曲干酪未開始成熟的風味及其成熟期風味變化的方向都存在著明顯差異。此外可以看出兩種干酪在成熟中期（16～24 d）的風味較為相似，隨成熟時間進一步延長，兩種干酪風味向不同的方向變化，因此成熟后期兩種干酪的風味存在較大差異。

2.5 兩種干酪不同成熟期風味物質(zhì)分析結(jié)果

對兩種霉菌干酪不同成熟期的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行了氣相色譜-質(zhì)譜分析。由表3～6可知，白霉干酪共檢出44 種化合物，包括11 種酸、9 種酮、10 種醇、8 種酯和6 種其他化合物；紅曲干酪共檢出47 種化合物，包括12 種酸、10 種酮、10 種醇、8 種酯和7 種其他化合物。隨成熟時間延長，兩種干酪各類物質(zhì)總量的變化趨勢相似，但在種類和含量上均存在不同程度的差異。

2.5.1 酸類化合物

酸類干酪中的酸類化合物主要有3 種來源，包括脂肪水解、蛋白水解和乳糖發(fā)酵[7]。直鏈脂肪酸（碳原子數(shù)大于4）是脂肪水解的產(chǎn)物，而支鏈酸（如2-甲基丙酸或3-甲基丁酸）主要是蛋白水解產(chǎn)生的氨基酸通過去氨基作用形成的化合物，醋酸和丙酸是乳糖發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物[21]。鑒定出的酸類化合物主要是一些短鏈和中鏈脂肪酸，這些有機酸都曾被報道為干酪中的重要氣味物質(zhì)[22]，大多數(shù)酸類化合物含量在成熟過程中存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。由表3可知，來源于脂肪水解的羧酸（丁酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十四酸和月桂酸）含量最豐富，占酸類化合物總含量的90%以上，由此可以看出白霉干酪和紅曲干酪的酸類化合物主要來自脂肪水解所產(chǎn)生的脂肪酸。羧酸本身不僅是香氣化合物，而且還是其他重要風味化合物的前體，如甲基酮、醇、內(nèi)酯、醛和酯[23]。由圖5可知，在成熟期前16 d，羧酸類物質(zhì)的含量一直增加，16 d之后逐漸開始下降。因為在成熟前期，微生物快速增長，大分子物質(zhì)水解生成脂肪酸的速率加快，脂肪酸含量上升，隨著成熟時間延長，部分脂肪酸作為前體物質(zhì)被消耗，且12 d后成熟溫度降低為4 ℃，脂肪酶活性下降，脂肪酸代謝速率低于生成速率，因此出現(xiàn)降低趨勢。短鏈和中間鏈羧酸被認為是風味形成的關(guān)鍵因素，而且每種脂肪酸都有其特有的風味，其中偶數(shù)脂肪酸因其較低的感知閾值對干酪整體氣味有更大的貢獻，其中乙酸、己酸、丁酸、甲基丁酸和辛酸是Camembert干酪最有效的氣味劑。甲基丁酸與丁酸具有典型的汗味、奶酪味，己酸是一種脂肪分解產(chǎn)生的短鏈羧酸，具有辛辣和酸味，辛酸具有酸味和汗味，是山羊奶酪的典型的香氣物質(zhì)[24-25]。乙酸和丙酸含量在成熟期24 d一直增長，之后開始有少量的降低，說明在干酪成熟過程中負責乳酸代謝的微生物在成熟期前期的活性可能更強，成熟期后期溫度降低為4 ℃且霉菌大量生長，乳酸代謝受到一定的抑制，且后期乙酸和丙酸作為前體合成其他風味物質(zhì)。乙酸和丙酸在白霉干酪中的含量明顯高于紅曲干酪，可能是紅曲霉代謝產(chǎn)物的存在一定程度上抵制了乳酸菌的生長。紅曲干酪中的2-甲基丁酸、3-甲基丁酸含量顯著高于白霉干酪，由蛋白水解度的測定結(jié)果可知，紅曲干酪中紅曲霉的加入促進了干酪中的蛋白水解。紅曲干酪中丁酸、己酸、月桂酸含量顯著高于白霉干酪，而辛酸、癸酸含量卻低于白霉干酪。紅曲霉在干酪中的應用研究較少，根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合相關(guān)文獻分析，紅曲酶的加入對有機酸的影響可能主要有3 個方面：第一是其存在對干酪中的產(chǎn)乙酸和丙酸的細菌可能具有一定的抑制作用，有研究報道紅曲霉可以產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)[10]；第二是紅曲霉自身產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶可能加速干酪中蛋白和脂肪的水解，有關(guān)紅曲霉代謝酶類的研究主要是針對糖化酶和酯化酶，對于蛋白酶和脂肪酶的研究較少，尤其是其應用于干酪中的代謝途經(jīng)還有待進一步研究；第三是紅曲發(fā)酵液中的一些紅曲代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、紅曲多糖、莫納卡琳-K等物質(zhì)的存在對Camembert青霉的生長和代謝以及脂肪水解的環(huán)境具有一定的影響，這些因素都會影響最終脂肪酸產(chǎn)物的含量。且隨成熟期的延長，有機酸逐漸被用于合成為甲基酮、酯類等物質(zhì)，脂肪酸含量的差異也可能與其在酯化反應中的利用率有關(guān)。

表 3 兩種干酪不同成熟時間的有機酸類揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 3 Volatile organic acid profiles of two cheeses with different ripening times ng/g

圖 5 兩種干酪不同成熟時間的酸類化合物的含量變化Fig. 5 Changes in acid contents of two cheeses with different ripening times

2.5.2 酮類化合物

酮類化合物由于其典型的氣味和低氣味閾值在表面霉菌成熟型干酪的風味形成中起著十分關(guān)鍵的作用。由圖6可知，隨成熟時間延長，兩種干酪的酮類化合物含量不斷增加。由表4可知，在兩種干酪中鑒定出的酮類均為甲基酮，甲基酮是霉菌干酪揮發(fā)性成分中含量最多的中性化合物，特別是在Camembert干酪和藍紋干酪中[26]。這類物質(zhì)通常有奇數(shù)個碳鏈（C3～C15），除了2-羥基丁酮外，碳原子為偶數(shù)的甲基酮在表面霉菌成熟型干酪中含量很少。2-戊酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮、2-癸酮是表面成熟型干酪的特征風味物質(zhì)[27]。甲基酮是以脂肪酸為前體合成的，脂肪酸經(jīng)酶催化氧化生成β-酮酸，β-酮酸去羰基生成少一個碳原子的甲基酮[28]，故甲基酮的含量與相應的脂肪酸含量有關(guān)，由表3、4對比發(fā)現(xiàn)，甲基酮與相應的脂肪酸的含量變化多呈負相關(guān)，因為產(chǎn)物的生成，即意味著前體物質(zhì)被消耗。將兩種干酪酮類化合物含量對比發(fā)現(xiàn)，其中含量最多的是2-庚酮、2-壬酮，其次是2-丁酮、2-十一酮。紅曲干酪中2-丁酮、2-十一酮、2-十三酮含量明顯高于白霉干酪，而壬酮、辛酮、癸酮、癸烯酮含量低于白霉干酪，紅曲霉對于干酪中甲基酮的影響與脂肪水解產(chǎn)生的脂肪酸前體含量差異有著直接的關(guān)系。如白霉干酪中的辛酸含量較高，其合成的相應甲基酮（2-壬酮）在白霉干酪中總體高于紅曲干酪；在紅曲干酪中月桂酸的含量較高，其合成的十一酮在紅曲干酪含量總體也高于白霉干酪。因此在酮類化合物中紅曲干酪含有的水果香氣物質(zhì)更多，而白霉干酪含有的奶香味物質(zhì)更多。2-戊酮、2-十一酮和2-十三酮具有典型的水果香氣；2-壬酮、2-辛酮、2-羥基丁酮是產(chǎn)生牛乳香氣的主要物質(zhì)，表現(xiàn)為熱牛乳味和黃油味，因此酮類也是大多數(shù)乳制品的主要風味；庚酮與霉菌干酪蘑菇味和堅果味的產(chǎn)生有關(guān)，壬烯酮、癸烯酮則會給干酪?guī)硪环N焙烤的香氣[29]。

表 4 兩種干酪不同成熟時間的酮類揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 4 Volatile ketone profiles of two cheeses with different ripening times ng/g

圖 6 兩種干酪不同成熟時間的酮類化合物的含量變化Fig. 6 Changes in ketone contents of two cheeses with different ripening times

2.5.3 醇類化合物

表 5 兩種干酪不同成熟時間的醇類揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 5 Volatile alcohol profiles of two cheeses with different ripening times

圖 7 兩種干酪不同成熟時間的醇類化合物的含量變化Fig. 7 Changes in alcohol contents of two cheeses with different ripening times

由圖7可以看出，隨著成熟時間延長，兩種干酪中的醇類化合物含量在前16 d快速增加，16 d之后開始逐漸下降，在成熟期后期，雖然兩種干酪中醇類化合物含量都開始下降，但是紅曲干酪中的醇類化合物降低速率顯著低于白霉干酪。在40 d成熟期，紅曲干酪中醇類化合物含量一直顯著高于白霉干酪（P＜0.05）。霉菌軟質(zhì)干酪中具有典型的醇類化合物主要是1-辛烯-3-醇、苯乙醇、甲基丁醇和丁二醇。1-辛烯-3-醇在霉菌干酪中含量較高且閾值低，迄今為止被認為是Camembert干酪和藍紋干酪產(chǎn)生蘑菇味的主要香氣物，但其含量過高，干酪也會產(chǎn)生不良的風味[30]。由表5可知，隨成熟時間延長，1-辛烯-3-醇在兩種干酪中不斷積累，含量逐漸增加，白霉干酪中1-辛烯-3-醇的含量比紅曲干酪中略高一些。Kubi?cková等發(fā)現(xiàn)，當在干酪中加入相應的辛烯酮后，這種蘑菇味的強度會隨之增大[31]。苯乙醇有典型的花香和蜂蜜香氣[32]，在白霉干酪成熟第8天含量達到最大值，之后含量逐漸下降；而在紅曲干酪中苯乙醇含量在第16天達到最大值，之后含量變化較小，紅曲干酪醇類總含量顯著高于白霉干酪的主要原因是其含有較高含量的苯乙醇（表5）。

在兩種干酪中含量比較高的仲醇是2-庚醇和2-壬醇，其具有乙醇香氣，其含量變化與相應甲基酮的變化相關(guān)。2,3-二丁醇是兩種干酪中唯一鑒定出的二級醇，具有水果香氣，它在干酪成熟期前16 d含量較高，之后含量開始下降，且在紅曲干酪中的含量顯著高于白霉干酪。2,3-二丁醇含量與相應甲基酮（2-丁酮）的含量呈正相關(guān)，由表4可知，紅曲干酪中2-丁酮含量較高，所以紅曲干酪中二丁醇含量也高于白霉干酪。

2.5.4 酯類化合物

大多數(shù)酯類都有花香和果香，而且可以減少脂肪酸和胺所帶來的辛辣和苦味。由圖8可以看出，兩種干酪中酯類化合物隨成熟時間延長含量不斷增加，到32 d之后含量逐漸穩(wěn)定，不再增加，甚至還有少量的下降。目前認為干酪中乙酯合成方式多以酯化反應和醇解反應為主，其中需要利用的酶體系分別為酯酶和醇?；D(zhuǎn)移酶。Malcata等發(fā)現(xiàn)在一些乳酸菌、酵母菌或霉菌的參與下，還有其他途徑可以生成乙酯類物質(zhì)，如酸解反應和酯交換反應[33]。奶酪隨成熟時間延長乙酯含量經(jīng)常呈現(xiàn)下降趨勢，因為酯酶水解酯生成醇和酸等物質(zhì)。Liu等發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌可以水解短鏈和中鏈酯類化合物[34]；Fenster等發(fā)現(xiàn)乳酸菌、霉菌和酵母中酯酶還能水解烷基酯類化合物[35]；干酪中酯類化合物的積累取決于酯的合成和水解，其最終平衡點主要依靠反應環(huán)境，如水分活度、底物濃度等，而這些因素處于動態(tài)變化中，因此酯類化合物含量也處于一種動態(tài)平衡。由表6可以看出，兩種干酪鑒定出的酯類化合物主要是內(nèi)酯和乙酯類化合物。內(nèi)酯是一種環(huán)狀酯，其是由醇酸通過分子間酯化形成的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，α-內(nèi)酯和β-內(nèi)酯不穩(wěn)定，通常作為有機物合成過程的中間產(chǎn)物，γ-內(nèi)酯和σ-內(nèi)酯比較穩(wěn)定，不容易分解，內(nèi)酯具有很強的芳香氣味，雖然這些氣味并不是真正的干酪風味，但它們與干酪風味的形成有很大的關(guān)系[36]。在兩種干酪中鑒定出的內(nèi)酯有兩種，分別是σ-癸內(nèi)酯和σ-十二內(nèi)酯，具有椰子味和黃油味，σ-癸內(nèi)酯是白霉干酪在未成熟時唯一檢測到的酯類，隨成熟時間延長，白霉干酪中內(nèi)酯含量比較穩(wěn)定，紅曲干酪成熟后期內(nèi)酯含量一定程度增加。乙酯類化合物尤其是C2～C10的乙酯類化合物，使奶酪擁有果香風味，如蘋果、香蕉、菠蘿等特征風味，對奶酪整體風味的平衡起促進作用。根據(jù)目前的研究報道，奶酪中常見的乙酯類化合物有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，在不同種類的奶酪中，乙酯種類和含量差異很大[37]。由表6可知，在成熟過程中紅曲干酪中酯類化合物含量總體高于白霉干酪，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因一是紅曲干酪在未成熟時即含有較多的酯類，這可能是由于初期加入的紅曲霉發(fā)酵液中本身含有一些酯類化合物。除此之外紅曲霉代謝可以產(chǎn)生較多酯酶，有研究表明紅曲霉產(chǎn)生的酯酶在白酒釀造過程中促進了己酸乙酯、辛酸乙酯等芳香味物質(zhì)的合成，故其常用于白酒釀造中以提高其感官品質(zhì)。此外由2.5.3節(jié)分析可知紅曲干酪中還含有較多的醇類化合物，這些因素都促進了酯類化合物的合成，故紅曲干酪中的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量顯著高于白霉干酪。

表 6 兩種干酪不同成熟時間的酯類揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 6 Volatile ester profiles of two cheeses with different ripening times

圖 8 兩種干酪不同成熟時間的酯類化合物的含量變化Fig. 8 Changes in ester contents of two cheeses with different ripening times

2.5.5 其他化合物

在兩種霉菌干酪中還發(fā)現(xiàn)了一些其他化合物，包括戊醛、苯乙醛、癸五烯、右旋檸檬烯、甲苯、丁羥基甲苯、癸烷、辛烷、醋酸銨。醛是一種不穩(wěn)定的化合物，由于能迅速還原為初級醇或氧化成相應的酸而不積聚在奶酪中。苯甲醛具有堅果味，是由色氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)化形成，對干酪整體的良好風味有重要作用。右旋檸檬烯是萜類物質(zhì)，具有檸檬、橘子的香氣。甲苯、丁羥基甲苯等苯環(huán)類化合物的形成可能與色氨酸、苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化有關(guān)，這些物質(zhì)含量高時會帶來一些不良的風味。烴類和醋酸鹽對于風味的貢獻很小，這些物質(zhì)在干酪中含量很低，大多僅在成熟期的某段時間被檢出。

3 結(jié) 論

本實驗以Camembert干酪的制作工藝為基礎，制作兩種不同的Camembert干酪：一種將從腐乳中分離的紅曲霉作為輔助發(fā)酵劑加入干酪中；另一種不加入紅曲霉作為對照。通過對兩種霉菌干酪質(zhì)構(gòu)和風味成分的測定，探究紅曲霉作為輔助發(fā)酵劑對Camembert干酪成熟期質(zhì)構(gòu)和風味變化的影響。結(jié)果表明，加入紅曲霉后，干酪的水分質(zhì)量分數(shù)和蛋白水解度有一定的提高，干酪的黏著性提高，而硬度、彈性、膠性、咀嚼性和回復性降低，說明加入紅曲霉后干酪口感更柔軟、質(zhì)地更加均勻。通過電子鼻對兩種干酪不同成熟期整體香氣輪廓的變化進行分析，隨成熟期延長，白霉干酪和紅曲干酪未開始成熟的風味以及其成熟期風味變化的方向都存在明顯差異，但紅曲干酪初期的風味與白霉干酪后期的風味在整體香氣輪廓上較為接近。通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對兩種干酪的揮發(fā)性物質(zhì)進行定性定量分析，將鑒定出的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)分為有機酸類、酮類、醇類和酯類物質(zhì)，針對其成熟期的含量變化以及兩種干酪風味變化的差異性進行分析。結(jié)果表明，紅曲霉的加入對于干酪成熟期4 類風味物質(zhì)的總體變化趨勢影響較小，但其對于不同風味物質(zhì)的含量有一定的影響。加入紅曲霉后，各類有機酸的含量都有一定的改變，其具體影響的代謝途徑還有待進一步研究。紅曲霉對有機酸含量的變化也直接影響了以其為前體合成的甲基酮類、醇類和酯類物質(zhì)的合成，還有紅曲霉代謝產(chǎn)生的酯酶對于酸類和醇類的利用以及己酸乙酯、辛酸乙酯等酯類物質(zhì)的合成具有重要影響。這些物質(zhì)含量差異會使紅曲干酪相比白霉干酪奶香味（壬酮、辛酮、壬烯酮、癸酮等）、蘑菇味（1-辛烯-3醇）物質(zhì)含量較少而果香味（2-丁酮、2-十一酮、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯）花香和蜂蜜香味（苯乙醇、丁二醇等）物質(zhì)含量較多。