枳術(shù)丸對(duì)脾虛證慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9的影響

湯文娟 夏旭婷 劉富林

〔摘要〕 目的 觀察枳術(shù)丸對(duì)脾虛證慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）小鼠結(jié)腸AQP3、AQP9表達(dá)的影響，探討枳術(shù)丸改善STC癥狀的可能作用機(jī)制。方法 將50只SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分成正常組（15只）和造模組（35只），造模組采用復(fù)合因素法（番瀉葉+限水+控制飲食）建立脾虛證STC小鼠模型，造模成功后造模組小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組（10只）、枳術(shù)丸組（10只）、莫沙必利組（10只）。連續(xù)給藥7 d后，檢測(cè)各組小鼠的糞便含水量、腸道推進(jìn)率、血清木糖含量及結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)特征;免疫組化及Western blot法檢測(cè)AQP3、AQP9蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組相比，模型組小鼠糞便含水量顯著減少，腸道推進(jìn)率顯著降低，血清木糖含量顯著降低，小鼠結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)顯著增多，AQP9表達(dá)顯著減少（P<0.01）;與模型組相比，枳術(shù)丸組小鼠糞便含水量顯著增加（P<0.05），腸道推進(jìn)率顯著升高（P<0.01），血清木糖含量顯著升高（P<0.01），小鼠結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)顯著減少，AQP9表達(dá)顯著增加（P<0.01）;與莫沙必利組相比，枳術(shù)丸組小鼠腸道推進(jìn)率升高（P<0.05），血清木糖含量顯著升高（P<0.01），結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)顯著減少（P<0.01），AQP9表達(dá)顯著增加（P<0.01），糞便含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 STC的發(fā)病與結(jié)腸黏膜AQP3上調(diào)、AQP9下調(diào)有關(guān)，枳術(shù)丸可以通過下調(diào)AQP3的表達(dá)、上調(diào)AQP9的表達(dá)，增加糞便的含水量而改善STC。

〔關(guān)鍵詞〕 慢傳輸型便秘;枳術(shù)丸;脾虛證;結(jié)腸黏膜;AQP3;AQP9

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Zhizhu Pill on the expressions of AQP3 and AQP9 in the colon of mice with slow transit constipation （STC） of spleen deficiency pattern， and to explore the possible mechanism of Zhizhu Pill in improving STC symptoms. Methods The total of 50 SPF Kunming mice were randomly divided into normal group （n=15） and model-building group （n=35）. The STC mouse model of spleen deficiency pattern was established by compound factor method [Fanxieye （Sennae Folium）+ water restriction + diet control]. After successful modeling， the mice of model-building group were randomly divided into model group （n=10）， Zhizhu Pill group （n=10）， and Mosapride group （n=10） according to their body weight. After 7 days of continuous drug administration， the fecal water content， intestinal propulsion rate， serum xylose content as well as histopathological characteristics of colonic mucosa were determined. Immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expressions of AQP3 and AQP9 proteins. Results Compared with? normal group， the fecal water content， the intestinal propulsion rate， and the serum xylose content of the mice in model group were significantly lower， the expression of AQP3 in mice colonic mucosa was significantly higher， and the expression of AQP9 was significantly lower （P<0.01）. Compared with model group， the fecal water content， the intestinal propulsion rate， and the serum xylose content of Zhizhu Pill group were significantly higher （P<0.05， P<0.01， P<0.01）， the expression of AQP3 in mice colonic mucosa was significantly lower， and the expression of AQP9 was significantly higher （P<0.01）. Compared with mosapride group， the intestinal propulsion rate and the serum xylose content of Zhizhu Pill group were significantly higher （P<0.05， P<0.01）， the expression of AQP3 in mice colonic mucosa was significantly lower（P<0.01）， and the expression of AQP9 was significantly higher （P<0.01）. The difference of fecal water content between the two groups was of no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The pathogenesis of slow transit constipation is related to the up-regulation of AQP3 and the down-regulation of AQP9 in colonic mucosa; Zhizhu Pill can relieve slow transit constipation by down-regulating the expression of AQP3， up-regulating the expression of AQP9， and increasing the water content of stool.

〔Keywords〕 slow transit constipation; Zhizhu Pill; spleen deficiency pattern; colonic mucosa; AQP3; AQP9

慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）屬于功能性便秘的一種，它是指結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)較緩慢，腸道動(dòng)力降低，腸內(nèi)容物在腸道停留時(shí)間過長、不能順利排出為特點(diǎn)的慢性便秘，主要癥狀是排便周期延長（嚴(yán)重者5～6 d解1次大便）、糞便排出費(fèi)力、糞質(zhì)干結(jié)或量少，調(diào)查顯示STC的發(fā)病率女性多于男性[1]。關(guān)于STC發(fā)病機(jī)制的研究是近幾年學(xué)術(shù)研究的熱門，普遍認(rèn)為STC的發(fā)病與腸道動(dòng)力不足及腸道內(nèi)水分吸收異常有關(guān)[2]。長期的慢性便秘會(huì)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，引起精神焦慮，嚴(yán)重者可引起急性腸梗阻、腸壞死穿孔等危急重癥[3]。因此，加強(qiáng)對(duì)STC發(fā)病機(jī)制的研究，找到治療STC穩(wěn)定可靠的治療手段，受到高度關(guān)注。20世紀(jì)80年代，科學(xué)家從紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了一種能傳輸水分子的蛋白質(zhì)，后經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終鑒定為水通道蛋白，并把它命名為“Aquaporin（AQP）”[4]。目前，在所有哺乳動(dòng)物身體內(nèi)至少已找到了13種水通道蛋白（AQP0～AQP12）[5]。水通道蛋白廣泛分布在機(jī)體的各個(gè)組織器官中，參與機(jī)體的水液代謝，而胃腸道又是機(jī)體水液新陳代謝中最活躍的臟器，所以，水通道蛋白在胃腸道水液的運(yùn)輸與新陳代謝過程中，扮演著關(guān)鍵的角色[6]。其中AQP3、AQP9在結(jié)腸表達(dá)活躍，參與結(jié)腸內(nèi)水液的吸收與分泌，大量研究證實(shí)[7-8]，AQP3與水液吸收呈正相關(guān)，能促進(jìn)結(jié)腸對(duì)水液的吸收從而發(fā)生便秘，AQP9與水液分泌呈正相關(guān)，它能促進(jìn)結(jié)腸內(nèi)水液的分泌而改善便秘。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于STC的治療有一定的局限性，中醫(yī)學(xué)作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，對(duì)于STC的治療有著巨大的優(yōu)勢(shì)，它能從根本上改善患者的便秘體質(zhì)，越來越多的便秘患者選擇接受中醫(yī)藥治療。枳術(shù)丸由白術(shù)、枳實(shí)兩味中藥組成，該方藥少力專，方中以白術(shù)為主藥，枳實(shí)為輔藥，兩藥按2∶1的比例配伍，兩藥配伍，具有健脾益氣、行氣導(dǎo)滯之功，枳術(shù)丸切中脾虛證STC的發(fā)病機(jī)制，臨床療效確切[9]。莫沙必利是選擇性5-羥色胺4受體（5-hydroxytryptamine 4 receptor， 5-HT4R）激動(dòng)劑，能通過促進(jìn)乙酰膽堿的釋放而發(fā)揮促胃腸動(dòng)力作用，減少糞便在腸道內(nèi)停留的時(shí)間，從而減少糞便水分的重吸收，使糞質(zhì)變稀，是臨床治療STC的常用藥物。此外，前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)[10]，脾虛證STC小鼠結(jié)腸黏膜AQP4、AQP8表達(dá)升高，莫沙必利與枳術(shù)丸均能通過下調(diào)AQP4、AQP8的水平而增加糞便含水量，因此本實(shí)驗(yàn)選擇將莫沙必利作為陽性對(duì)照藥。已知結(jié)腸內(nèi)AQP的表達(dá)異常是STC的發(fā)病機(jī)制之一，而枳術(shù)丸是治療STC的有效方劑，目前尚無研究證實(shí)枳術(shù)丸能同時(shí)上調(diào)與水液吸收呈負(fù)相關(guān)的AQP9和下調(diào)與水液吸收呈正相關(guān)的AQP3，有待深入廣泛的研究。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇AQP3、AQP9為檢測(cè)指標(biāo)，通過在分子水平上觀察枳術(shù)丸對(duì)脾虛證STC小鼠結(jié)腸AQP3、AQP9表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討枳術(shù)丸改善STC癥狀的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

50只健康昆明小鼠，體質(zhì)量為（20±2） g，SPF級(jí)，雌性25只，雄性25只。購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0009，合格證號(hào)：430727211102193536。

1.2? 藥物

生白術(shù)200 g、麩炒枳實(shí)100 g，先加3 L的清水浸泡30 min，再煎煮40 min，并過濾藥液后再次加2.4 L清水煎煮40 min，合并2次藥液，并將藥液濃縮成濃度為1 kg/L的藥液，分裝入塑膠瓶中，封口，編號(hào)，置于4 ℃冰箱冷藏備用;番瀉葉500 g加5 L沸水浸泡10? min，并過濾藥液，濃縮成濃度為1 kg/L的藥液，裝入塑膠瓶中，封口，編號(hào)，放置在4 ℃冰箱冷藏后備用;枸櫞酸莫沙必利（國藥準(zhǔn)字號(hào)：H19990313，批號(hào)：1E018，規(guī)格：5 mg/片）;以上藥物均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.3? 儀器與試劑

臺(tái)式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TG16-WS）;顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)BX51）;電泳儀（北京六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C）;掃描儀（EPSON，型號(hào)V300）;勻漿儀（康濤科技有限公司，型號(hào)KZ-II）;D-木糖試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A035）;PBS緩沖液（谷歌生物，貨號(hào)G0002）;兔抗AQP3抗體（貨號(hào)OM271461）、兔抗AQP9抗體（貨號(hào)OM167205）均購自美國OmnimAbs生物公司;顯影定影試劑（武漢皮諾飛生物科技有限公司，貨號(hào)G2019）;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢皮諾飛生物科技有限公司，貨號(hào)S8010）;BSA（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號(hào)G5001）。

2 方法

2.1? 分組

50只小鼠隨機(jī)分為正常組15只、造模組35只。造模15 d后，兩組各抽取5只小鼠用于模型驗(yàn)證，造模成功后正常組剩10只，造模組剩30只，再將造模組30只小鼠隨機(jī)分為模型組、枳術(shù)丸組、莫沙必利組，每組10只。

2.2? 造模

參考夏旭婷等[11]方法建立脾虛型STC模型，具體方法流程包括：前7天用番瀉葉按20 g/（kg·d）灌胃，灌胃濃度為1 kg/L，正常飲食飲水，造成脾虛模型;第8～15天停用番瀉葉，隔天喂生米，每次6 g/只，飲水30 min，造成便秘模型，造模時(shí)間共15 d，最后復(fù)制出脾虛證小鼠STC模型。小鼠外形瘦弱、皮肉松懈，毛質(zhì)粗獷萎黃，活動(dòng)遲緩，部分拱背，納食少，體質(zhì)量增長緩慢。糞便干結(jié)、量少粒細(xì)，檢測(cè)腸道推進(jìn)率和血清D-木糖水平明顯下降，HE染色未見結(jié)腸黏膜器質(zhì)性變化，表示模型建立成功。

2.3? 給藥

造模完成后，按小鼠與成人給藥系數(shù)計(jì)算出小鼠的每天給藥量，枳術(shù)丸組按9.0 g/（kg·d）（生藥含量）給藥，莫沙必利組按2.5 mg/（kg·d）給藥，模型組和正常組給予0.1 mL/10 g蒸餾水灌胃，每天2次，持續(xù)給藥7 d。

2.4? 取材

小鼠禁食不禁水24 h，除正常組2只小鼠外，其余每只小鼠灌胃0.3 mL D-木糖溶液，20 min后開始眼球取血，血液靜置于1.5 mL離心管中以備離心;眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出幽門至回盲部的全部腸道，測(cè)量腸道推進(jìn)率;最后將橫結(jié)腸剪成約2 cm的小段，取3段，分別用生理鹽水清洗，2段放在多聚甲醛液中固定，以備HE染色及免疫組化，另1段放在凍存管中，置于-80 ℃冰箱，以備Western blot檢測(cè)。

2.5? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.5.1? 小鼠一般行為學(xué)觀察及排便觀察? 每天觀察及記錄小鼠的活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度及排便情況，每3天記錄一次體質(zhì)量。

2.5.2? 糞便含水量檢測(cè)? 收集小鼠造模前、造模后、治療后3 h內(nèi)的糞便并稱取糞便濕重，放入干燥機(jī)中烘干3 h，稱取干重，測(cè)定糞便含水量。糞便含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

2.5.3? 腸道推進(jìn)率檢測(cè)? 測(cè)量幽門至回盲部的腸道全長和染黑腸道的長度。腸道推進(jìn)率=（染黑腸道長度/腸道全長）×100%。

2.5.4? 血清D-木糖含量檢測(cè)? 將離心管對(duì)稱放入離心機(jī)中，以3500 r/min的速率，離心半徑13.5 cm，離心15 min，提取血清，根據(jù)木糖試劑盒說明書步驟，應(yīng)用比色分析法測(cè)定各組小鼠血清D-木糖含量。

2.5.5? 結(jié)腸黏膜病理檢測(cè)? 取出固定好的結(jié)腸組織，脫水，石蠟包埋，做成0.4 μm的組織切片，用HE染色法，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜病理改變，并拍照記錄。

2.5.6? 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9的表達(dá)? ? 先將固定好的切片組織干燥12 h，再放入二甲苯中脫蠟，然后用不同濃度的乙醇逐級(jí)脫水，蒸餾水浸泡5 min;將切片放置在PBS緩沖液中，煮沸15 min，再冷卻15 min，冷卻后用PBS緩沖液洗滌3次，每次3 min;加入1%高碘酸，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次，每次3 min;滴加適當(dāng)稀釋（1∶400）的一抗（AQP3、AQP9），4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加與一抗相同種屬的二抗，室溫孵育50 min;滴加預(yù)先準(zhǔn)備好的顯色劑DAB濃縮液50～100 μL，室溫溫度以孵育1～5 min為宜，在鏡下調(diào)節(jié)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，用蒸餾水浸泡;蘇木素復(fù)染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán);再用不同濃度乙醇逐級(jí)脫水，取出后放入二甲苯10 min，用中性樹膠封片、顯微鏡下觀測(cè)。

2.5.7? Western blot檢測(cè)結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9蛋白的表達(dá)? 組織塊用PBS洗滌，剪成小塊置于勻漿器;勻漿液移入離心管中，4 ℃離心，2100 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm;取上清再次離心，4 ℃，2100 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm;再將離心后的上清（漿蛋白）置于-20 ℃冰箱保存;沉淀為膜蛋白，用PBS緩沖液漂洗，棄組織塊;離心，4 ℃，2100 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm;BCA法測(cè)蛋白濃度;清洗玻璃板，灌膠與上樣，按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，梳子插入濃縮膠中，加足夠的電泳液后上樣電泳。濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V;電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶，封閉1 h;除去封閉液，加入稀釋好的一抗4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝?根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”形式表示，采用單因素方差分析，兩兩比較時(shí)選擇LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 小鼠一般行為學(xué)觀察及排便觀察

正常組小鼠外形飽滿，表現(xiàn)敏捷，納食正常，大便質(zhì)軟成形，量一般，體質(zhì)量持續(xù)增長。造模組小鼠反應(yīng)速度遲緩，外形瘦弱、毛質(zhì)粗獷萎黃，納食少，體質(zhì)量增長緩慢，大便初期稀溏，次數(shù)增加，后期大便逐漸變硬，頻次、數(shù)量均減少，糞便顆粒細(xì)小。造模成功后，給予不同藥物干預(yù)，枳術(shù)丸組小鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)佳，外形較前豐滿，反應(yīng)速度變靈敏，納食日漸增多，體質(zhì)量逐步增長，大便日漸變軟，數(shù)量增加，顆粒變大。莫沙必利組小鼠精神、外形、皮色毛質(zhì)、反應(yīng)較前無改善，但納食明顯增加，體質(zhì)量逐漸增長，大便較前變軟，數(shù)量增加，顆粒變大。

3.2? 糞便含水量檢測(cè)

與正常組相比，造模后（2周），模型組小鼠糞便含水量減少（P<0.01）;與模型組相比，治療后（3周）枳術(shù)丸組小鼠糞便含水量增加（P<0.05）;枳術(shù)丸組與莫沙必利組相比，兩組之間糞便含水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;說明便秘模型復(fù)制成功。詳見表1。

3.3? 腸道推進(jìn)率檢測(cè)

與正常組相比，模型組小鼠腸道推進(jìn)率明顯降低（P<0.01）;經(jīng)枳術(shù)丸及莫沙必利干預(yù)后，小鼠腸道推進(jìn)率顯著升高（P<0.01），且兩組之間以枳術(shù)丸的效果最好（P<0.05）。詳見表2。

3.4? 血清D-木糖含量檢測(cè)

與正常組相比，模型組小鼠血清D-木糖含量顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，枳術(shù)丸組、莫沙必利組小鼠血清D-木糖含量均顯著升高（P<0.01），且以枳術(shù)丸組升高顯著（P<0.01）。詳見表3。

3.5? 結(jié)腸黏膜病理檢測(cè)

各組小鼠黏膜病理檢測(cè)結(jié)果無較大差別，均未發(fā)現(xiàn)明顯黏膜器質(zhì)性損傷，模型組部分結(jié)腸黏膜可見少量炎癥細(xì)胞浸潤、腺體固有層間隙增寬等表現(xiàn)。詳見圖1。

3.6? 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9的表達(dá)

與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜AQP3分布密集，表達(dá)顯著增多（P<0.01），而AQP9分布稀疏，表達(dá)顯著減少（P<0.01）;經(jīng)枳術(shù)丸及莫沙必利干預(yù)后，小鼠結(jié)腸黏膜AQP9表達(dá)增多（P<0.01），AQP3表達(dá)減少（P<0.01），且兩組之間以枳術(shù)丸的干預(yù)效果更明顯（P<0.01）。詳見表4、圖2—3。

3.7? Western blot檢測(cè)結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9的表達(dá)

與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)增多（P<0.01），AQP9表達(dá)減少（P<0.01）;經(jīng)枳術(shù)丸及莫沙必利干預(yù)后，AQP3表達(dá)顯著減少（P<0.01），AQP9表達(dá)顯著增加（P<0.01），且兩組之間以枳術(shù)丸的干預(yù)效果更明顯（P<0.01）。結(jié)果見圖4、表5。

4 討論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)疾病證候表現(xiàn)，將STC歸屬于“便秘”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為便秘是由于腸道傳導(dǎo)功能失常，致使大便秘結(jié)不通，出現(xiàn)排便周期延遲，或糞質(zhì)干結(jié)，或排便不暢的病癥。大腸的主要功能是傳化糟粕和主津。大腸主傳化糟粕即是指飲食物通過大腸的重吸收功能形成糞便，并在腸道的蠕動(dòng)作用下向外排出的過程。大腸主津是指大腸吸收飲食糟粕中部分津液，使之形成有形之糞便的作用。若大腸主津功能失常，過度吸收食物糟粕中的津液而造成大便干結(jié)或腸道本身津液匱乏，胃腸失于濡養(yǎng)，導(dǎo)致糞便艱澀難出，出現(xiàn)便秘。便秘的病位雖然主要在大腸，卻與其他臟腑如脾、胃、肺、肝、腎等臟腑的功能失調(diào)相關(guān)[12]，其中主要與脾胃的關(guān)系最為密切。六腑以通為用，飲食由口入胃，在胃氣的通降作用下飲食糟粕才能下傳大腸并排出體外，故胃氣失于通降，則導(dǎo)致腸道傳導(dǎo)失職。此外胃中有實(shí)熱，消爍腸道津液，也會(huì)導(dǎo)致腸道干枯，大便秘結(jié)。脾具有運(yùn)化功能，既能運(yùn)化谷食也能運(yùn)化水飲。脾能布散津液，將飲食水谷中吸收的津液布散于全身，以發(fā)揮濡養(yǎng)作用。若脾氣虛，運(yùn)化功能失常，不能輸布布散津液，導(dǎo)致胃腸津液不足，大便干燥而發(fā)為便秘。大腸的傳導(dǎo)功能還有賴于脾氣的充足，具體表現(xiàn)為兩點(diǎn)，其一，脾氣能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，推動(dòng)腸道運(yùn)行;其二，脾可以化生氣血以濡養(yǎng)腸道。若脾氣不足，推動(dòng)作用減弱，腸道蠕動(dòng)緩慢，則發(fā)生腹脹、便秘;脾氣不足，氣血生化乏源，腸道津液不足，失于濡潤，亦可發(fā)為便秘。根據(jù)便秘病理因素的不同，可將便秘分為虛實(shí)兩大類，STC屬于虛證類的便秘。虛證類的便秘主要包括氣虛型、津虧型、陽虛型。脾氣既能推動(dòng)腸道運(yùn)行，也能化生氣血以濡養(yǎng)腸道，故脾虛既能導(dǎo)致氣虛也能導(dǎo)致津虧，因此健運(yùn)脾胃是治療STC的核心治法。

枳術(shù)丸是臨床治療脾虛便秘的有效方劑，該方藥少力專，由白術(shù)、枳實(shí)兩味中藥組成，是由張仲景的枳術(shù)湯化裁而來，枳術(shù)湯與枳術(shù)丸在藥物組成上一樣，但藥物配比不一樣。枳術(shù)丸中以白術(shù)為主藥，枳實(shí)與白術(shù)用量為1∶2，主治脾虛食積之痞證，具有健脾行氣消痞之功，補(bǔ)大于消。枳實(shí)性味辛、苦，主歸脾、胃兩經(jīng)，辛味藥具有行氣作用，能行中焦胃腸之氣，苦味藥具有通泄作用，能通泄大便。白術(shù)性味甘溫，主歸脾胃兩經(jīng)，甘味藥具有補(bǔ)益作用，能健脾益氣，主治脾氣虛弱主證。枳術(shù)丸方中白術(shù)健脾益氣，培補(bǔ)脾胃為主藥，枳實(shí)行氣導(dǎo)滯為輔藥，兩藥合用，使脾虛得補(bǔ)，氣滯得行。枳術(shù)丸藥少力專，直達(dá)病所，臨床上對(duì)STC的治療效果顯著[13]。

STC主要是以胃腸道傳輸遲緩、大便干燥為特點(diǎn)，便秘患者結(jié)腸內(nèi)水分的異常分泌或吸收可能是STC的發(fā)病機(jī)制之一。腸道的主要功用是吸收水分，使糞便成形，并能分泌一定的黏液潤滑腸道，促使糞便順利排出。AQP是位于細(xì)胞膜上的一種轉(zhuǎn)運(yùn)載體，作為載體它可以轉(zhuǎn)運(yùn)水分子、甘油、尿素等小分子，在人體內(nèi)廣泛分布，尤其是水液代謝活躍的結(jié)腸，它參與結(jié)腸對(duì)水分的吸收與分泌作用[14]。AQP在腸道內(nèi)正常表達(dá)，腸道內(nèi)的水液代謝得以正常進(jìn)行，AQP表達(dá)的增加或減少，則會(huì)引起便秘或腹瀉。目前已有研究證明，AQP3、AQP9在胃腸道大量分布，參與了胃腸道內(nèi)水分的吸收和分泌[15]。AQP3主要分布于腎臟、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)。在消化系統(tǒng)中AQP3主要分布在遠(yuǎn)端結(jié)腸與胃賁門腺黏膜，它不僅能促進(jìn)結(jié)腸對(duì)水分的吸收，還能促進(jìn)結(jié)腸對(duì)甘油、尿素等的轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。KON等[17]研究表明嗎啡能夠上調(diào)結(jié)腸組織AQP3表達(dá)，從而增強(qiáng)由側(cè)腔到血管側(cè)的水分吸收，而導(dǎo)致便秘。周永學(xué)等[18]研究表明，升高結(jié)腸AQP3的水平能有效改善腹瀉。錢海華等[19]研究證實(shí)，通便顆粒能減少腸道AQP3的表達(dá)，進(jìn)而改善便秘。AQP9主要存在于肝臟及腸道，尤其在近端結(jié)腸及遠(yuǎn)端小腸中高度表達(dá)[20]，參與腸內(nèi)保護(hù)黏膜及促進(jìn)腸內(nèi)黏液的吸收與分泌。冉呂等[21]研究表明AQP9在近端結(jié)腸中具有分泌黏液的功能，但對(duì)于便秘患者近端結(jié)腸AQP9表達(dá)降低，提示AQP9表達(dá)的減少促進(jìn)了便秘的發(fā)生。耿學(xué)斯等[22]實(shí)驗(yàn)證明，便秘大鼠AQP9低表達(dá)、AQP3 高表達(dá)。在蔣峰等[23]實(shí)驗(yàn)中，采用復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型，通過計(jì)算每周的糞便含水率，用PCR及Western blot法測(cè)定AQP3和AQP9基因和蛋白表達(dá)狀況，結(jié)果表明模型組的糞便含水率顯著減少，AQP3表達(dá)增多，而AQP9表達(dá)降低，表明糞便含水率和AQP9的表達(dá)呈正相關(guān)，與AQP3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，AQP3、AQP9在結(jié)腸的異常表達(dá)均可導(dǎo)致便秘，與STC的發(fā)病密切相關(guān)，同時(shí)也給臨床治療STC提供了新的思路和靶點(diǎn)。

STC以腸道運(yùn)行緩慢、糞質(zhì)干結(jié)、排便量少為主要表現(xiàn)，屬于功能性便秘的類型，故我們選擇腸道推進(jìn)率來評(píng)估腸道動(dòng)力，選擇糞便含水量來評(píng)估大便干結(jié)情況，觀察小鼠排便情況來評(píng)估是否符合大便量少的情況，以結(jié)腸黏膜病理檢測(cè)反映結(jié)腸有無器質(zhì)性病變。有研究表明，血清D-木糖含量是反映脾虛狀態(tài)異常的指標(biāo)之一，可以反映腸道的吸收功能，故本實(shí)驗(yàn)選則小鼠血清D-木糖含量作為驗(yàn)證脾虛證模型的客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠外形瘦弱、毛質(zhì)粗獷萎黃，納食少，體質(zhì)量增長緩慢，反應(yīng)速度遲緩，大便質(zhì)硬，量少，顆粒細(xì)小，糞便含水量降低，腸道推進(jìn)率顯著減少，血清D-木糖含量也減少，并且結(jié)腸黏膜無器質(zhì)性病變，符合臨床上脾虛證STC的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)選擇枳術(shù)丸組作為實(shí)驗(yàn)組，將莫沙必利組作為陽性對(duì)照組，結(jié)果顯示，經(jīng)過藥物治療干預(yù)后，枳術(shù)丸組和莫沙必利組小鼠體質(zhì)量均較造模前明顯增加，排便情況也較模型組明顯改善，腸道推進(jìn)率及血清D-木糖含量也顯著超過了模型組，且枳術(shù)丸改善程度優(yōu)于莫沙必利。前期研究結(jié)論證實(shí)，由于水通道蛋白在腸道內(nèi)的異常表達(dá)引起了結(jié)腸對(duì)水分的過度吸收，從而引起了便秘的發(fā)生，其中AQP3、AQP9在結(jié)腸黏膜表達(dá)活躍，因此本實(shí)驗(yàn)選擇AQP3和AQP9作為檢測(cè)指標(biāo)，并通過免疫組化和Western blot法測(cè)定其在結(jié)腸黏膜的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果和Western blot結(jié)果均顯示模型組小鼠結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)升高，而AQP9表達(dá)降低。經(jīng)過枳術(shù)丸干預(yù)后，小鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9表達(dá)恢復(fù)正常水平，說明枳術(shù)丸可通過下調(diào)AQP3的水平并上調(diào)AQP9的水平來抑制結(jié)腸對(duì)水分的重吸收，增加糞便含水量。

參考文獻(xiàn)

[1] 崔文文， 管忠安. 中醫(yī)診治慢性便秘現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2021， 30（36）： 4094-4099.

[2] 吳本升， 陳玉根. 慢性傳輸性便秘病理基礎(chǔ)研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 28（5）： 824-825.

[3] VAZQUEZ ROQUE M， BOURAS E P. Epidemiology and management of chronic constipation in elderly patients[J]. Clinical Interventions in Aging. 2015， 10： 919-930.

[4] 龐? 坤， 劉英麗， 韓立強(qiáng). 水通道蛋白結(jié)構(gòu)及調(diào)控的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué)， 2015， 36（12）： 69-72.

[5] 張麗婭， 王永兵. 水通道蛋白在便秘腸道表達(dá)的中西醫(yī)研究進(jìn)展[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥， 2019， 26（35）： 25-28.

[6] DANIALI M， NIKFAR S， ABDOLLAHI M. An overview of interventions for constipation in adults[J]. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology， 2020， 14（8）： 721-732.

[7] 詹? 敏， 尹園緣， 李? 逵， 等. 益氣滋陰湯治療慢傳輸型便秘大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2021， 27（5）： 40-43.

[8] 馮? 智， 陳? 強(qiáng)， 李毅忠， 等. 黃芪增液湯對(duì)便秘大鼠結(jié)腸AQP9的表達(dá)影響[J]. 中醫(yī)臨床研究， 2020， 12（6）： 147-149.

[9] 宗? 陽， 孫明明， 樂音子， 等. 白術(shù)-枳實(shí)配伍治療慢傳輸型便秘的研究概述[J]. 中國藥房， 2018， 29（16）： 2300-2304.

[10] 樊俊陽. 枳術(shù)丸對(duì)STC模型小鼠結(jié)腸組織AchE、5-HT7R及水通道蛋白表達(dá)的影響[D]. 長沙： 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 2015.

[11] 夏旭婷， 樊俊陽， 王碧玉， 等. 脾虛證慢傳輸型便秘小鼠模型構(gòu)建方法的比較研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 34（12）： 4-7， 81.

[12] 吳勉華， 王新月. 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M]. 9版. 北京： 中國中醫(yī)藥出版社， 2012.

[13] 章? 慧. 生白術(shù)與枳實(shí)配伍治療慢傳輸型便秘的臨床研究[D]. 南京： 南京中醫(yī)藥大學(xué)， 2017.

[14] BLACK C J， FORD A C. Chronic idiopathic constipation in adults： Epidemiology， pathophysiology， diagnosis and clinical management[J]. The Medical Journal of Australia， 2018， 209（2）： 86-91.

[15] FINN R N， CERDà J. Evolution and functional diversity of aquaporins[J]. The Biological Bulletin， 2015， 229（1）： 6-23.

[16] 趙廣西. 水通道蛋白3和8在消化系統(tǒng)的表達(dá)及其在炎癥性腸病動(dòng)物模型中的改變[D]. 上海： 復(fù)旦大學(xué)， 2014.

[17] KON R， IKARASHI N， NAGOYA C， et al. Rheinanthrone， a metabolite of sennoside A， triggers macrophage activation to decrease aquaporin-3 expression in the colon， causing the laxative effect of rhubarb extract[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2014， 152（1）： 190-200.

[18] 周永學(xué)， 王郁金， 張? 紅， 等. 血管活性腸肽對(duì)便秘大鼠排便及結(jié)腸組織中VIP-cAMP-PKA-AQP3信號(hào)通路的影響[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2016， 41（11）： 1175-1180.

[19] 錢海華， 徐天舒， 曾? 莉， 等. 通便顆粒調(diào)節(jié)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸水通道蛋白3， 水通道蛋白8表達(dá)的研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014， 20（24）： 180-184.

[20] 趙凱科， 鄭? 立， 毛智斌， 等. 水通道蛋白與胃腸道疾病關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2016， 37（1）： 77-80.

[21] 冉? 呂， 梅浙川. 水通道蛋白9與消化系統(tǒng)疾病[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2013， 10（8）： 1000-1002.

[22] 耿學(xué)斯， 羅春華， 肖秋平， 等. 腸潤方對(duì)功能性便秘大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP9表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2016， 31（11）： 4699-4703.

[23] 蔣? 峰， 周錦勇， 劉明浩， 等. 養(yǎng)陰潤腸方對(duì)便秘小鼠結(jié)腸水通道蛋白3/9的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2018， 24（5）： 114-120.