蜥蜴散對慢性萎縮性胃炎模型大鼠IL-6的影響

黃 婷，陳一帆，張 燕，黃衛(wèi)東，梁 巖

慢性萎縮性胃炎(CAG)是指胃黏膜在各種致病因素作用下胃黏膜反復(fù)受到刺激導(dǎo)致的胃黏膜變薄、胃固有腺體萎縮等病理改變，是臨床常見的消化道疾病，特別是當(dāng)其伴發(fā)腸上皮化生并誘發(fā)不典型增生或異型增生時(shí)被認(rèn)為是胃癌的癌前病變[1]。由于單純的西醫(yī)治療效果欠佳，臨床上常采用中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合進(jìn)行治療[2]。實(shí)踐表明，蜥蜴散對CAG具有良好的治療作用[3-4]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立CAG大鼠模型，初步探討蜥蜴散對CAG模型大鼠胃黏膜及血清IL-6的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物：清潔級SD雄性大鼠18只，鼠齡4周，體重(100±20)g，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SYXK(寧)：2015-0001。隨機(jī)分為3組，即空白對照組、慢性萎縮性胃炎模型組、蜥蜴散治療組，編為A～C組，空白對照組(A組)6只，CAG模型組(B組)6只，蜥蜴散治療組(C組)6只，相同條件下分籠飼養(yǎng)，喂SPF大小鼠生長繁殖飼料，自由飲水，給食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：蜥蜴散(由蜥蜴粉、鹿角霜粉、海螵蛸粉、炒白術(shù)粉、半枝蓮粉等組成)由寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)消化病研究所提供,4%水楊酸鈉(分析純)由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)(CAS No.:54-21-7)，銅綠假單胞菌新鮮菌液由寧夏醫(yī)科大學(xué)生化與分子生物學(xué)教研室提供，IL-6單克隆抗體(MB9020)和二抗(BS12478)均由南京巴傲得生物科技有限公司提供，光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)為日本奧林巴斯產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH)，電泳儀(北京六一儀器廠)，搖床(上海柏欣機(jī)械廠)，光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS)，電子天平(上海民橋儀器公司)，離心機(jī)(HITACHI)，RM2125石蠟切片機(jī)(德國 LEICA 公司)。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制：蜥蜴散混懸液制備，即：蜥蜴散經(jīng)過粉碎、蒸2.5 h，晾干后用滅菌后的去離子水分別配成0.3 g/mL糊劑混懸液裝瓶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞褐苽洌禾羧慰寺【溥^夜搖菌并作為種子，種子每個(gè)星期重?fù)u活化一次，配置LB培養(yǎng)基并將種子按1∶100加入LB培養(yǎng)基搖菌過夜且使菌液的OD在0.5左右。

1.3.2 造模及治療方法：A組大鼠正常飼養(yǎng)。B、C組用4%水楊酸鈉和過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌交替灌胃，10 mL/(kg·d)，處理8周。8周后A組繼續(xù)正常飼養(yǎng)，B組繼續(xù)4%水楊酸鈉和過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌交替灌胃；C組用蜥蜴散混懸液灌胃，每只每次給藥20 mL/(kg·d)，周一到周五給藥，周六、周天休息,共治療4周。

1.3.3 組織標(biāo)本的處理:第12周末，將各組大鼠禁食禁水24 h后，麻醉，剖腹取出全胃，沿胃大彎側(cè)切開，用生理鹽水沖洗，40 g/L中性甲醛固定、酒精脫水、二甲苯將組織透明，然后進(jìn)行浸蠟、包埋，為進(jìn)行HE染色及免疫組化法檢測做準(zhǔn)備。

1.3.4 HE染色：將組織制成4.5 μm的石蠟切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20min→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min→95%、90%、80%、70%酒精中各2 min→蒸餾水速洗→蘇木精染胞核10 min→用自來水洗去多余的蘇木精→用1%的鹽酸酒精分化數(shù)s→用自來水藍(lán)化30 min→0.5%～1%伊紅水溶液染 2 min→70%、80%、90%、95%酒精中各2 min→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min→二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明20 min→中性樹膠封片。

1.3.5 免疫組化法：將組織制作成切片，厚度3～5 μm，經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)等常規(guī)步驟后，用抗體IL-6(1∶200)4 ℃孵育過夜后，室溫復(fù)溫45 min，再用HRP一復(fù)合物孵育1 h，然后DAB顯色，蘇木精染核，封片。

1.3.6 Western 印跡檢測蛋白表達(dá)：心臟取血后靜置過夜，取血清置于-20 ℃冰箱保存。將血清稀釋4倍后用BCA法檢測血清蛋白濃度，并用PBS將血清蛋白濃度調(diào)整為50 mg/mL。將蛋白于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜50 min，用含 5% 脫脂牛奶的 TBST 封閉膜 2 h，加入IL-6兔抗鼠單克隆抗體(1∶1 000)及內(nèi)參TF兔抗鼠單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后用TBST漂洗3次，加二抗(1∶50 000)室溫孵育1 h，滴加發(fā)光試劑暗室曝光顯示條帶。

2 結(jié)果

2.1 不同組間大鼠病理組織學(xué)觀察：空白對照組胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，慢性萎縮性胃炎模型組胃黏膜見不同程度萎縮，蜥蜴散治療組病理結(jié)果有改善，說明蜥蜴散具有改善大鼠胃黏膜腸化、異型增生的效果。

2.2 不同組間大鼠免疫組化法結(jié)果:IL-6陽性顆粒表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色或深棕色染色，免疫組化法結(jié)果鏡下觀察到各組間均有IL-6分泌，空白對照組可見IL-6大量表達(dá)，CAG模型組IL-6表達(dá)明顯下降，蜥蜴散治療組IL-6表達(dá)回升，見圖1-圖3(目錄后)。

2.3 不同組間大鼠血清Western blot結(jié)果:與對照組比較，慢性萎縮性胃炎模型組IL-6的表達(dá)明顯下調(diào)，經(jīng)過蜥蜴散治療的大鼠血清中IL-6的表達(dá)量有了明顯的回升。

2.4 不同組間大鼠血清IL-6含量的比較：模型組大鼠血清IL-6含量為(0.11±0.09)ng/L，對照組血清為(0.64±0.04)ng/L，治療組為(0.65±0.04)ng/L，模型組血清IL-6含量低于對照組(P<0.05)，治療組與模型組相比，血清IL-6顯著回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組與對照組相比，血清IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明CAG大鼠有炎癥損傷，蜥蜴散具有促進(jìn)IL-6分泌的作用，使血清IL-6水平回升。

3 討論

CAG是一種常見、多發(fā)的消化系統(tǒng)疾病，它是由幽門螺桿菌感染，有遺傳因素、免疫因素、飲食等多因素共同誘發(fā)的結(jié)果，伴有不典型增生時(shí)被視為癌前病變[5]。由于該病不是先天性疾病，目前對其病因、發(fā)病機(jī)制及治療的研究只能依賴于誘發(fā)動(dòng)物模型，比如采取幽門螺桿菌感染，水楊酸鈉、酒精、膽酸等化學(xué)物質(zhì)損傷胃黏膜[6]等方式造模，建立類似人類慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采取水楊酸鈉和銅綠假單胞菌液交替灌胃的方式造模，12周后經(jīng)過HE染色、常規(guī)光鏡組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠的胃部已發(fā)生萎縮性胃炎特異性病理改變，說明成功建立了大鼠CAG模型，且方法簡便易行。

近年來，感染因素、免疫因素及其共同涉及的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與萎縮性胃炎及癌前病變的關(guān)系越來越受到人們的重視。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，IL-6在CAG的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，IL-6是一種多效促炎細(xì)胞因子，參與多種生物學(xué)過程。陶梅[8]等人研究發(fā)現(xiàn)，熱水灌胃可導(dǎo)致大鼠萎縮性胃炎的形成，在此形成過程中，IL-6和IL-8的含量明顯升高。2014年周語平[9]等人報(bào)道，慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃組織IL-6與正常相比明顯升高，用升陽益胃湯高劑量治療后IL-6表達(dá)明顯下降。2016年劉利民[10]等人研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃連素在治療萎縮性胃炎中可顯著降低患者血清中 IL-6水平。張靜霜[11]等研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方蜥蜴散對CAG模型大鼠有明顯的治療作用，并降低模型大鼠血清中TNF-α含量。我們應(yīng)用水楊酸鈉和銅綠假單胞菌液交替灌胃建立的大鼠CAG模型，大鼠病理組織和血清中的IL-6含量顯著下降，而經(jīng)過蜥蜴散治療后IL-6明顯回升，這反映了CAG致病機(jī)理和中藥作用機(jī)制的復(fù)雜性。蜥蜴散治療可提高CAG模型大鼠胃組織和血清中IL-6含量，其機(jī)制可能與IL-6調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。由于本文研究樣本數(shù)較少，上述研究結(jié)果還有待于今后大樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的證實(shí)，蜥蜴散治療引起IL-6含量增高的原因和生物學(xué)意義尚待進(jìn)一步的深入研究去證實(shí)。

本研究結(jié)果仍有一定的局限性，首先，為小樣本實(shí)驗(yàn)性研究，需要進(jìn)一步增加樣本量來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其次，在大鼠體內(nèi)觀察到CAG大鼠血清IL-6下降而治療后IL-6回升，但在人體內(nèi)的IL-6尚不清楚；最后，由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜,對其作用機(jī)制還要從多環(huán)節(jié)進(jìn)一步研究，了解細(xì)胞因子在疾病中的作用機(jī)制，可以為治療并預(yù)防該疾病提供一定的理論依據(jù)。