肺炎患者痰液分離鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因分析*

戴曉玥，吳亮，陰晴，夏雯，鄒治情，周亞玲，何蕾，Dinsh Kumar K, 許化溪

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)屬于不動(dòng)桿菌屬，是引起重癥肺炎的主要病原體。不動(dòng)桿菌屬中的鮑曼不動(dòng)桿菌、未命名基因種3和13TU表型相近，臨床僅統(tǒng)稱(chēng)為醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplex)，但準(zhǔn)確鑒定出鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)監(jiān)控醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生有重要意義[1]。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是目前治療鮑曼不動(dòng)桿菌的首選藥物，但近年來(lái)該菌的耐藥性上升迅速，給鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶和主動(dòng)外排泵的激活是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2]。本研究分析江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科重癥肺炎患者分離的鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶各種β-內(nèi)酰胺酶基因和主動(dòng)外排泵基因的情況，旨在了解耐藥菌的耐藥機(jī)制，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1菌株收集 研究對(duì)象為2017年9月至2018年12月間江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科確診重癥肺炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)感染疾病協(xié)會(huì)/美國(guó)胸科協(xié)會(huì)(IDSA/ATS)中重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括2項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)和9項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)。主要標(biāo)準(zhǔn)：(1)需要有創(chuàng)機(jī)械通氣；(2)感染性休克需要血管收縮劑治療。次要標(biāo)準(zhǔn)：(1)呼吸頻率≥30次/分；(2)氧合指數(shù)≤250；(3)多肺葉浸潤(rùn)；(4)低體溫(T<36 ℃)；(5)白細(xì)胞減少(WBC<4.0×109/L)；(6)血小板減少(血小板<100×109/L)；(7)低血壓，需要強(qiáng)力的液體復(fù)蘇；(8)意識(shí)障礙/定向障礙；(9)氮質(zhì)血癥(≥20 mg/dL)。符合1項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)或3項(xiàng)以上次要標(biāo)準(zhǔn)者納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫性疾?。?2)合并嚴(yán)重心、肝和腎臟器疾病；(3)合并血液系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤；(4)無(wú)法留取合格痰標(biāo)本者。所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。用一次性無(wú)菌吸痰管經(jīng)氣管插管或氣管切開(kāi)處收集合格痰標(biāo)本，同一患者相同部位多次分離菌株不重復(fù)記入。共收集醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體160株，所有菌株均經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體。其中男性101例，女性59例，年齡35～80歲。所有菌種以15%脫脂乳保存液凍存于-80 ℃中。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2主要儀器與試劑 細(xì)菌培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套板卡(法國(guó)生物梅里埃公司)；梯度PCR儀(美國(guó)ABI公司)。LB培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司)；羰基氰氯苯腙(CCCP，美國(guó)Sigma公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工公司)；2×Taq Master Mix(南京諾唯贊公司)；DNA Marker(上海捷瑞公司)；JS-780型凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)；引物由蘇州泓迅生物科技公司合成。

1.3藥敏試驗(yàn) 用Vitek 2 Compact及配套藥敏卡(GN13)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；米諾環(huán)素、阿米卡星、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑同時(shí)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.4細(xì)菌DNA抽提 挑取單個(gè)菌落接種3 mL LB培養(yǎng)基于37 ℃(220 r/min)培養(yǎng)12～16 h，吸取200 μL菌液用于細(xì)菌DNA抽提。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，提取產(chǎn)物最終重新溶解于100 μL滅菌蒸餾水中，-20 ℃保存。

1.5二重PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌 根據(jù)文獻(xiàn)[3]合成鮑曼不動(dòng)桿菌特異性檢測(cè)引物(Ab-ITS)，其目的片段為鮑曼不動(dòng)桿菌16S-23S RNA間隔區(qū)域(ITS)差異較大區(qū)域；合成不動(dòng)桿菌檢測(cè)引物(rA)，其目的片段為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌16S rRNA序列中高度保守片段。采用二重PCR技術(shù)鑒定菌株，引物序列見(jiàn)表1。二重PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，各條引物(25 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 1.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，各引物退火溫度和時(shí)間見(jiàn)表1，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后送上海生工公司測(cè)序分析，并根據(jù)GenBank中的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核酸比對(duì)分析。

1.6鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[4-6]合成引物。其中碳青霉烯酶類(lèi)相關(guān)基因包括A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM、blaPER和blaCARB)、B類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶基因(blaIMP和blaVIM)、C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶基因(blaADC和blaDHA)、D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶基因(blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51和blaOXA-58)；主動(dòng)外排泵相關(guān)基因包括adeB、adeJ、macB、emrB、emrA、abeS、abeM和craA，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，各對(duì)引物退火溫度和時(shí)間見(jiàn)表1，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后送上海生工公司測(cè)序分析，并根據(jù)GenBank中的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核酸比對(duì)分析。

表1 引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度

1.7泵抑制劑CCCP干預(yù)試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]方法并略加改進(jìn)：CCCP干預(yù)試驗(yàn)中，在含有不同亞胺培南藥物濃度的LB培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μg/mL的CCCP(二甲基亞砜溶解)，并按1∶1 000加入亞胺培南耐藥株細(xì)菌懸液(A600 nm=0.6)， 35 ℃溫育16 h，觀察生長(zhǎng)情況，記錄菌株對(duì)亞胺培南的最低抑菌濃度(MIC)值并計(jì)算MIC50和MIC90。比較CCCP作用前后菌株對(duì)亞胺培南MIC值的變化，以加入CCCP后菌株MIC值降低至少是原值的1/4，判斷為外排泵陽(yáng)性菌株。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用 Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1二重PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌結(jié)果 160株醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中，143株(89.4%)擴(kuò)增出2個(gè)條帶(rA和Ab-ITS)，大小分別為425 bp和208 bp；17株(10.6%)醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體僅擴(kuò)增出1個(gè)425 bp條帶(rA)。見(jiàn)圖1。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)，143株菌Ab-ITS擴(kuò)增產(chǎn)物序列與鮑曼不動(dòng)桿菌相似度大于99%(Accession：DQ108594.1)，確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌；9株菌rA擴(kuò)增產(chǎn)物序列與A.pittii相似度大于99%(Accession：MG786615.1)，確認(rèn)為A.pittii；8株菌rA擴(kuò)增產(chǎn)物序列與A.nosocomialis相似度大于99%(Accession：KM281501.1)，確認(rèn)為A.nosocomialis。

注：M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1，rA陽(yáng)性，其他不動(dòng)桿菌；2—10，鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖1二重PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌部分電泳結(jié)果

2.2鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 143株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南(83.2%)、環(huán)丙沙星(87.4%)、復(fù)方磺胺甲噁唑(85.3%)、頭孢他啶(85.3%)、頭孢曲松(85.3%)、頭孢吡肟(85.3%)、米諾環(huán)素(85.3%)、妥布霉素(83.2%)的耐藥率均高于80%，左氧氟沙星耐藥率為55.9%，對(duì)阿米卡星耐藥率較低(19.3%)。

2.3β-內(nèi)酰胺酶耐藥相關(guān)基因檢測(cè) 143株鮑曼不動(dòng)桿菌均攜帶blaOXA-51基因，117株(81.8%)攜帶blaOXA-23基因，141株(98.6%)攜帶blaADC基因，57株(39.9%)攜帶blaTEM基因，1株(0.7%)攜帶blaDHA基因，其他β-內(nèi)酰胺酶基因均未檢出。見(jiàn)圖2。

2.4主動(dòng)外排泵相關(guān)基因檢測(cè) 143株鮑曼不動(dòng)桿菌中檢出adeB陽(yáng)性129株，adeJ基因143株，macB基因143株，emrB基因129株，emrA基因121株，abeS基因139株，abeM基因143株，craA檢出143株。見(jiàn)圖3。

注：M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1，鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥相關(guān)基因PCR產(chǎn)物。

圖2鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥相關(guān)基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

注：M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1，adeB；2，adeJ；3，macB；4，emrB；5，emrA；6，abeS；7，abeM；8，craA。

圖3鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5β-內(nèi)酰胺酶基因及主動(dòng)外排泵基因與亞胺培南耐藥相關(guān)性分析 143株鮑曼不動(dòng)桿菌均攜帶blaOXA-51基因，blaADC基因、blaTEM基因、blaDHA基因在亞胺培南耐藥株和敏感菌株中的攜帶率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。blaOXA-23基因在亞胺培南耐藥組中攜帶率為98.3%，而敏感組中未檢出，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率P=0.000)。在主動(dòng)外排泵基因中，adeJ基因、macB基因、abeM基因和craA基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶率均為100%；emrB基因、emrA基因和abeS基因攜帶率也較高，耐藥株攜帶率高于敏感株，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；adeB基因在耐藥株攜帶率為98.3%，敏感株攜帶率為41.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率P=0.000)。見(jiàn)表2。

2.6CCCP干擾試驗(yàn)結(jié)果 加入泵抑制劑CCCP前后，部分亞胺培南耐藥株對(duì)亞胺培南MIC發(fā)生變化，其中109株菌MIC值降低至1/4，為外排泵基因陽(yáng)性菌株，8株菌MIC值降低至1/2，2株菌MIC沒(méi)有變化，且117株MIC值降低的菌株adeB基因均為陽(yáng)性。119株亞胺培南耐藥株對(duì)亞胺培南的MIC由16 μg/mL ～64 μg/mL降為2 μg/mL ～64 μg/mL。見(jiàn)表3。

表2亞胺培南耐藥株及亞胺培南敏感株間β-內(nèi)酰胺酶基因及主動(dòng)外排泵基因攜帶率比較

耐藥基因攜帶率(%)亞胺培南敏感株(n=24)亞胺培南耐藥株(n=119)Fisher精確概率P值blaTEM25.0042.900.116blaADC100.0098.301.0blaDHA0.001.701.0blaOXA-230.0098.300.000blaOXA-51100.00100.00-adeB41.6798.280.000adeJ100.00100.00-macB100.00100.00-emrB83.3391.380.188emrA66.6787.930.113abeS83.33100.000.101abeM100.00100.00-craA100.00100.00-

表3加入外排泵抑制劑CCCP前后亞胺培南耐藥株MIC變化

抗菌藥物MIC范圍(μg/mL)MIC50(μg/mL)MIC90(μg/mL)亞胺培南16～641664亞胺培南+CCCP2～64864

3 討論

由于鮑曼不動(dòng)桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌和不動(dòng)桿菌菌屬13TU在表型上高度相似，依靠現(xiàn)有的常規(guī)生化反應(yīng)鑒定方法無(wú)法區(qū)分。本研究中根據(jù)鮑曼不動(dòng)桿菌和其他不動(dòng)桿菌16S和23S rRNA基因的間隔區(qū)域(ITS)基因序列差異[3]，采用二重PCR技術(shù)，鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌和其他不動(dòng)桿菌，取得良好的效果，值得在臨床推廣使用。藥敏檢測(cè)表明，我院呼吸內(nèi)科重癥肺炎患者痰液中鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性嚴(yán)重，其中對(duì)亞胺培南耐藥率已高達(dá)83.2%，需引起臨床高度重視。而且，亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其他抗菌藥物，如β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，上述耐藥現(xiàn)象與其他醫(yī)院情況一致[8]。

產(chǎn)生藥物鈍化酶和主動(dòng)外排泵的激活是細(xì)菌重要的耐藥機(jī)制。我院亞胺培南耐藥株中檢出β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因包括blaTEM、blaADC、blaOXA-23和blaOXA-51，其中blaOXA-23和blaOXA-51基因在亞胺培南耐藥株中可以檢出，而敏感株中僅檢出blaOXA-51，由此推測(cè)產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶是我院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制之一，該結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[9-10]。OXA-23是對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物具有水解作用的一類(lèi)特殊的β-內(nèi)酰胺酶，又稱(chēng)為苯唑西林酶(oxacillinases, OXAs)，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦具有較強(qiáng)的耐受能力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，OXA-23在全球各地的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中流行最廣，主要通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移從其他菌株中導(dǎo)入鮑曼不動(dòng)桿菌基因組中[11]。OXA-23的編碼基因(blaOXA-23)位于轉(zhuǎn)座子中，已發(fā)現(xiàn)負(fù)載blaOXA-23基因的轉(zhuǎn)座子有Tn2006、 Tn2007、Tn2008和Tn2009[12]，但我院菌株blaOXA-23基因定位情況仍有待于進(jìn)一步研究。鮑曼不動(dòng)桿菌balOXA-23基因表達(dá)量與細(xì)菌亞胺培南等耐藥性相關(guān)，隨著balOXA-23表達(dá)量增加，細(xì)菌耐藥性顯著增強(qiáng)[13]。

我院鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶主動(dòng)外排泵基因有adeB基因、adeJ基因、macB基因、emrB基因、emrA基因、abeS基因、abeM基因和craA基因，但上述基因攜帶率在亞胺培南耐藥株和非耐藥株中的差異并不顯著，僅adeB基因的攜帶率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外排泵抑制試驗(yàn)也證實(shí)CCCP可以顯著降低亞胺培南耐藥株MIC值。研究發(fā)現(xiàn)adeABC基因與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥密切相關(guān)，adeABC通常呈現(xiàn)不表達(dá)或低表達(dá)，但其表達(dá)增加可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，并可以與 D類(lèi)碳青霉烯酶共同介導(dǎo)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥[14]。攜帶主動(dòng)外排泵adeB基因可能是誘導(dǎo)我院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的原因，但確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，我院呼吸內(nèi)科分離肺炎患者鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況嚴(yán)重，并攜帶多種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因和主動(dòng)外排泵基因。我們推測(cè)我院鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南耐藥與其攜帶β-內(nèi)酰胺酶blaOXA-23基因和主動(dòng)外排泵adeB基因密切相關(guān)，其中blaOXA-23基因可以作為多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的篩選標(biāo)記[13]。