沙眼衣原體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及篩查策略研究進(jìn)展*

周可，韓燕，尹躍平

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042)

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)是目前常見(jiàn)的性傳播疾病病原體之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)每年新增Ct感染人數(shù)達(dá)1.3億[1]。美國(guó)2017年報(bào)告170萬(wàn)例生殖道Ct感染[2]。自2008年，我國(guó)在105個(gè)性病監(jiān)測(cè)點(diǎn)將生殖道Ct感染列為單獨(dú)的一種性病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，2008—2015年平均感染率為32.48/10萬(wàn)～37.48/10萬(wàn)，年增長(zhǎng)率達(dá)1.95%[3]。Ct感染后有50%～70%的患者無(wú)明顯臨床癥狀，女性則達(dá)70%～80%[4]。然而，無(wú)論癥狀性感染和無(wú)癥狀感染都會(huì)導(dǎo)致后遺癥，主要影響女性生殖系統(tǒng)，可能出現(xiàn)盆腔炎、異位妊娠和輸卵管不孕[5]。此外，Ct與人乳頭瘤病毒和HIV的感染有關(guān)[4]。由于Ct目前仍缺乏有效疫苗，因此對(duì)Ct的防治主要依賴于早期篩查、早診斷和早治療,選擇高效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法對(duì)控制Ct感染具有重要的影響。本文就Ct檢測(cè)方法及檢測(cè)策略進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 檢測(cè)方法的進(jìn)展

1.1病原學(xué)檢測(cè)進(jìn)展 目前，對(duì)于Ct的病原學(xué)檢測(cè)主要包括直接涂片法、細(xì)胞培養(yǎng)法、抗原檢測(cè)法和核酸檢測(cè)法。直接涂片法應(yīng)用于眼部感染標(biāo)本的敏感性可達(dá)95%，但用于泌尿生殖道Ct感染的診斷時(shí)其敏感性和特異性均低[6]。細(xì)胞培養(yǎng)法被公認(rèn)是檢測(cè)Ct感染的金標(biāo)準(zhǔn)，是檢測(cè)衣原體活體唯一的實(shí)驗(yàn)方法，但該方法敏感性受標(biāo)本采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及污染的影響較大。目前細(xì)胞培養(yǎng)法在診斷實(shí)驗(yàn)室很少被使用，但在涉嫌性侵犯需要進(jìn)行高特異性的測(cè)試時(shí)仍然使用這種方法[7]。隨著衣原體抗原特異性單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，抗原檢測(cè)方法主要包括酶免法(EIA)、直接免疫熒光法(direct immunofluorescence assay, DFA)和免疫層析法(immunochromatography assay，ICA)，常用的抗原是Ct的主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)、熱休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)和脂多糖(LPS)。EIA法因操作簡(jiǎn)便、可自動(dòng)化判讀，適宜標(biāo)本篩查。DFA法適用多種標(biāo)本，具有敏感、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，但由于判讀受主觀因素影響，且熒光標(biāo)記物不穩(wěn)定，不適宜標(biāo)本篩查。ICA法因操作簡(jiǎn)單，省時(shí)快捷，對(duì)場(chǎng)地和設(shè)備要求低，目前在我國(guó)臨床上仍被廣泛應(yīng)用。

檢測(cè)微生物的核酸檢測(cè)(nucleic acid tests, NATs)技術(shù)主要有2種類型：培養(yǎng)確認(rèn)NATs技術(shù)和直接NATs技術(shù)。臨床Ct檢測(cè)主要采用直接NATs技術(shù)，其準(zhǔn)確性高于直接免疫學(xué)檢測(cè)方法。美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的第一個(gè)非放射性直接NATs試劑是Gen-Probe PACE試劑。但直接NATs技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)不如隨后開(kāi)發(fā)的加入目標(biāo)基因擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid amplification tests, NAATs)，隨后NAATs逐漸被認(rèn)為是Ct的首選檢測(cè)方法，并已取代培養(yǎng)成為診斷金標(biāo)準(zhǔn)[8]。NAATs可根據(jù)其檢測(cè)的核酸物質(zhì)分為DNA擴(kuò)增和RNA擴(kuò)增。DNA擴(kuò)增主要選擇位于MOMP的omp1基因、隱蔽質(zhì)粒靶基因；因瑞典的Ct新變種(new variant of CT, nvCT)的廣泛流行[9-10]，隨后增加可以保證檢測(cè)到nvCT的主要外膜蛋白OmpA保守序列的靶基因。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)以及金納米探針(AuNP)的比色法鑒定法檢測(cè)Ct，其敏感性高，可檢測(cè)低至11.25拷貝的目標(biāo)DNA[11]。而RNA擴(kuò)增主要基于RNA轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(transcription mediated amplification, TMA)對(duì)Ct的23S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)[12]。也可以選用Ct染色體基因作為Ct的靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)[13]。因每個(gè)感染細(xì)胞都含有大量的rRNA，TMA需要的設(shè)備為具有實(shí)時(shí)定量功能恒溫?cái)U(kuò)增儀，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不需要調(diào)節(jié)溫度，操作過(guò)程較為簡(jiǎn)單[14]。英國(guó)Twistdx公司開(kāi)發(fā)了一種等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法，該方法能在15 min內(nèi)檢測(cè)沙眼衣原體(Ct)/淋球菌(NG)感染，不需要熱循環(huán)，電池供電，反應(yīng)溫度為37 ℃。研究者選用男女不同標(biāo)本評(píng)價(jià)基于15 min運(yùn)行時(shí)RPA檢測(cè)Ct和NG原型的準(zhǔn)確性，使用常規(guī)臨床Ct/NG核酸擴(kuò)增試驗(yàn)作為對(duì)照，用Cepheid Ct/NG GeneXpert解決差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除男性尿標(biāo)本Ct特異性99.7%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值97.1%外，其他標(biāo)本類型的2種病原體的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%，故認(rèn)為該檢測(cè)試驗(yàn)具有優(yōu)良的性能特點(diǎn)，可與目前使用的NAATs相媲美，并基本符合WHO標(biāo)準(zhǔn)[15]。Chernesky等[16]對(duì)目前市場(chǎng)4種商業(yè)核酸檢測(cè)試劑使用情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GeneXpert Infinity 80因其檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)短，維護(hù)時(shí)間短，消耗較少而更具優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)表1。

可以通過(guò)保持標(biāo)本的低溫和盡量縮短標(biāo)本采集和處理之間的時(shí)間來(lái)維持標(biāo)本中Ct的生存能力。抗原檢測(cè)所需的標(biāo)本主要是尿道拭子和宮頸拭子，NAATs除了可選用尿道拭子和宮頸拭子，還可用尿液和陰道拭子等無(wú)創(chuàng)性標(biāo)本。根據(jù)女性人群篩查條件不同，選用陰道拭子還是宮頸拭子，依據(jù)檢查方式而定。Schachter等[17]研究表明陰道拭子標(biāo)本是感染篩查的首選標(biāo)本，但有癥狀的婦女需要進(jìn)行盆腔檢查，同時(shí)采集宮頸標(biāo)本。Nelson等[18]對(duì)使用不同女性標(biāo)本進(jìn)行NAATs檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出陰道拭子(臨床采集或自采)以及宮頸拭子均優(yōu)于尿液檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度(見(jiàn)表2)。對(duì)于男性人群，Chernesky等[19]對(duì)男性尿道拭子和首段尿標(biāo)本用NAATs進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示無(wú)論有無(wú)癥狀，尿液即可達(dá)到檢測(cè)要求，因此首段尿可以適用于男性人群的篩查。人群的干預(yù)項(xiàng)目需要招募更多人群參與，自采標(biāo)本可以節(jié)省大量的人力和物力。Alexander等[20]對(duì)同時(shí)檢測(cè)咽部和直腸部Ct感染無(wú)癥狀男性同性戀(men who have sex with men，MSM)人群自采標(biāo)本與臨床采集標(biāo)本的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示自采直腸拭子與護(hù)士采集直腸拭子并無(wú)明顯差異，而在自采和護(hù)士采集的咽部拭子間敏感性無(wú)差異但特異性差異顯著，部分自采標(biāo)本出現(xiàn)假陽(yáng)性，這可能與患者處理標(biāo)本不當(dāng)導(dǎo)致污染有關(guān)。運(yùn)輸自采的干燥拭子，能夠擴(kuò)大Ct的檢測(cè)服務(wù)范圍。Gaydos等[21]對(duì)郵遞的干燥拭子以及保存于保存液中拭子進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)所有配對(duì)干拭子和濕拭子均能檢測(cè)到Ct。

表1 不同核酸檢測(cè)平臺(tái)完成96份樣本所耗費(fèi)時(shí)間的比較

表2 不同樣本采集方式NAATs檢測(cè)的準(zhǔn)確性[18]

1.2血清學(xué)檢測(cè) 檢測(cè)血清中Ct抗體的方法已有數(shù)十年歷史，然而，由于與其他衣原體的交叉反應(yīng)而受到限制。隨著新的敏感特異的血清學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展，新的Ct血清學(xué)檢測(cè)有助于提高對(duì)Ct流行病學(xué)和預(yù)防的認(rèn)識(shí)。Budrys等[22]研究發(fā)現(xiàn)Ct抗原中的HSP60、CT376、CT557和CT443分別與稀釋血清樣本結(jié)合檢測(cè)后，可區(qū)分輸卵管因素不孕的婦女和具備正常生育能力的婦女，敏感性為63%(95%CI：0.41～0.77)，特異性為100%(95%CI：0.91～1)，這些抗原被指定為輸卵管因子不孕相關(guān)抗原，但不能用于區(qū)分輸卵管因素不孕患者和急性感染患者；而Ct抗原中的CT875和CT147可以檢測(cè)暴露于Ct人群中發(fā)生急性感染的婦女，其檢測(cè)敏感性為63%(95%CI：0.41～0.77)，特異性為100%(95%CI：0.95～1)，因此，CT875和CT147被指定為急性感染相關(guān)抗原；可以使用不同的Ct抗原的連續(xù)篩查來(lái)鑒別輸卵管因素不孕、正常生育和急性感染的婦女，并且抗原片段化和血清稀釋可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感性和特異性。Rahman等[23]對(duì)11種Ct肽抗原IgG1、IgG3和IgA1抗體的檢測(cè)結(jié)果與4種商品試劑結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有11個(gè)肽檢測(cè)結(jié)果敏感性均高于商品試劑，其中5個(gè)最佳肽的組合敏感性為86.5%。Ct的血清學(xué)檢測(cè)將來(lái)可以應(yīng)用于生殖道Ct控制項(xiàng)目評(píng)估、新的疫苗候選者評(píng)估，作為盆腔炎、輸卵管不育的單獨(dú)或組合生物標(biāo)記物檢測(cè)[24]。

2 篩查策略進(jìn)展

WHO在2016年全球“Towards Ending STIs”戰(zhàn)略中提出，將“廣泛篩查”作為2016—2030年降低90%性傳播疾病發(fā)病率的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。對(duì)Ct進(jìn)行篩查已被證明可以降低盆腔炎以及宮頸癌的發(fā)病率[25]。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)明確提出對(duì)于非孕期及孕期婦女的篩查策略，建議對(duì)于年齡<25歲、有新的或多個(gè)性伴侶、伴侶患有性傳播疾病、既往患有性病(如衣原體感染、淋病、梅毒或滴蟲(chóng)病等)、目前診斷其他性傳播疾病(淋病、梅毒或滴蟲(chóng)病等)、懷孕、從事商業(yè)性工作、監(jiān)禁等情況的婦女進(jìn)行Ct篩查[26]。雖然Ct流行率數(shù)據(jù)為制定有針對(duì)性篩查的行為準(zhǔn)則提供了依據(jù)，但對(duì)婦女發(fā)生性關(guān)系的男子的控制方案定義尚未達(dá)成共識(shí)。雖然沒(méi)有對(duì)異性戀男子進(jìn)行篩查的建議，但美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組(U.S. Preventive Services Task Force, USPSTF)2014年建議，在Ct感染高發(fā)的臨床環(huán)境(如性病診所、青少年診所、拘留和教養(yǎng)設(shè)施)和進(jìn)入武裝部隊(duì)或國(guó)家就業(yè)培訓(xùn)方案的人員中性活躍的異性戀男子應(yīng)給予檢測(cè)。Ct和淋球菌感染在某些人群(如MSM)的生殖器外部位很常見(jiàn)，而且大多數(shù)感染均無(wú)癥狀，因此建議每年對(duì)MSM人群生殖器外部位進(jìn)行常規(guī)篩查，但目前沒(méi)有關(guān)于女性生殖器官外常規(guī)篩查的建議[27]。在英國(guó)，早在2003年就提出確保所有25歲以下的性行為活躍者都了解衣原體，并獲得性健康服務(wù)，以減少感染風(fēng)險(xiǎn)或傳播。英格蘭公共衛(wèi)生組織建議性活躍人群應(yīng)每年予以Ct檢測(cè)，在不同環(huán)境中更換性伴侶的情況下應(yīng)予以檢測(cè)[28]。2005年，澳大利亞政府認(rèn)識(shí)到年輕人感染衣原體的公共衛(wèi)生問(wèn)題，并將檢測(cè)作為降低感染率的國(guó)家戰(zhàn)略[29]。在歐洲有證據(jù)顯示Ct監(jiān)測(cè)系統(tǒng)已取得進(jìn)展[30]。目前，在我國(guó)深圳啟動(dòng)了“淋病和生殖道沙眼衣原體綜合防治”項(xiàng)目，旨在探索中國(guó)生殖道Ct感染的防治策略。

即便診斷性能優(yōu)越的NAATs仍存在延遲報(bào)告結(jié)果時(shí)間的情況，從而可能導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)提供治療。此外，雖然臨床根據(jù)癥狀干預(yù)可以提供即時(shí)治療，但大多數(shù)Ct感染無(wú)癥狀，使得臨床漏診了大多數(shù)Ct感染者。因此，臨床檢測(cè)及大規(guī)模篩查需要床旁檢測(cè)(point-of-care tests，POCTs)，以允許在同一次訪問(wèn)中作出診斷和治療決定，確保即時(shí)治療并防止后續(xù)治療的損失。2006年，WHO提出了在一級(jí)健康中心使用POCT的“ASSURED”標(biāo)準(zhǔn)，隨著新技術(shù)的不斷開(kāi)發(fā)進(jìn)階為REASSURED原則，即增加至9個(gè)方面(real-time connectivity, ease of specimen collection and environmental friendliness, affordable, sensitive, specific, user-friendly, rapid and robust, equipment free, deliverable to end-users：實(shí)時(shí)性，樣本簡(jiǎn)單及環(huán)保獲得、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；敏感性；特異性；便利性；時(shí)效性；免儀器操作以及運(yùn)輸條件)，盡管在梅毒、衣原體、淋球菌感染和滴蟲(chóng)的POCT方面取得了顯著進(jìn)展，但截至目前，還沒(méi)有完全符合所有這些標(biāo)準(zhǔn)的診斷試驗(yàn)[31]。用于Ct檢測(cè)的POCT根據(jù)檢測(cè)方法不同分為抗原檢測(cè)和核酸檢測(cè)，以基于抗原的POCT檢測(cè)方法的敏感性較低，僅為11.6%～27.3%[32]；基于核酸的POCT方法是建立在封閉體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的基礎(chǔ)上以完全自動(dòng)化的方式進(jìn)行，大約需要90 min得到結(jié)果[33]。Kelly等[34]對(duì)POCT在Ct檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，對(duì)9項(xiàng)涉及8種抗原POCT的研究和2項(xiàng)核酸POCT研究評(píng)價(jià)后得出，抗原檢測(cè)對(duì)宮頸拭子、陰道拭子和男性尿液的總敏感性分別為53%、37%和63%，特異性分別為99%、97%和98%；核酸檢測(cè)對(duì)所有標(biāo)本類型的敏感性和特異性分別98%和99.4%。因此，Ct抗原檢測(cè)POCTs雖然使用方便，但缺乏足夠的敏感性，可推薦作為一種篩查試驗(yàn)，而NAAT因造價(jià)以及出結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)限制其使用。

3 展望

Ct的檢測(cè)方法對(duì)于發(fā)現(xiàn)Ct感染者有著重要價(jià)值，而目前基于抗原檢測(cè)的方法敏感性較低，不利于有效地發(fā)現(xiàn)感染者；基于核酸檢測(cè)的方法敏感性高，但是患者需要等待結(jié)果的時(shí)間長(zhǎng)，不利于及時(shí)地控制感染者；有關(guān)針對(duì)血清學(xué)檢測(cè)方法的研究目前正廣泛地開(kāi)展。Ct的篩查策略可以促進(jìn)人群的自我檢測(cè)和醫(yī)生的篩查意識(shí)，但因費(fèi)用效益比的問(wèn)題，如何制定合適的人群篩查策略，現(xiàn)在仍需要進(jìn)一步的研究和探索。