超深淵鉤蝦Eurythenes gryllus i型溶菌酶的基因克隆與表達

李雪雪,阮靈偉

(1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波315000；2.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

1922年，英國細菌學家Fleming從人的唾液和眼淚中觀察到一種能比較明顯溶解細菌細胞壁的成分，因為具有溶菌作用所以將其命名為溶菌酶[1]。1937年，Abraham和Robinson又實現(xiàn)了將溶菌酶晶體從卵蛋白中分離出來，從此開啟了對溶菌酶的研究，并不斷獲得新的發(fā)現(xiàn)[2]。

溶菌酶是一種堿性酶，能夠水解粘多糖，主要作用機理是通過催化水解細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1,4糖苷鍵，糖苷鍵水解后致使細菌細胞壁破裂，破裂的細胞壁會使得內(nèi)容物逸出從而導致細菌死亡[3]。研究表明溶菌酶發(fā)揮作用時有較強的底物特異性，當溶菌酶來源不同時，作用的底物也會不同[4]，已知的溶菌酶按來源不同可分為六大類：①鵝型溶菌酶，又稱g型溶菌酶(g-type)；②雞型溶菌酶，又稱c型溶菌酶(c-type)；③T4噬菌體溶菌酶；④無脊椎動物溶菌酶，又稱i型溶菌酶(i-type)；⑤植物溶菌酶；⑥細菌溶菌酶[5-10]。近年來i型溶菌酶被廣泛研究，它作為溶菌酶家族的新成員，在環(huán)節(jié)動物門、軟體動物門、棘皮動物門和節(jié)肢動物門中分布比較廣泛[11]。有些溶菌酶含有失穩(wěn)酶結構域。失穩(wěn)酶是在歐洲醫(yī)蛭(Haemopissanguisuga)中發(fā)現(xiàn)的，最初發(fā)現(xiàn)其有異肽酶活性，能特異性水解纖維蛋白ε-(γ-Glu)-Lys 的交聯(lián)鍵，進而使纖維蛋白發(fā)生水解[12]。后來，人們又在失穩(wěn)酶中也發(fā)現(xiàn)了糖苷酶活力，于是失穩(wěn)酶被認為是一種新的溶菌酶，并且進一步被認定為 i 型溶菌酶。由于失穩(wěn)酶既具有異肽酶活性，又具有糖苷酶活性，因此稱作DL(Destabilase-lysozyme)[13-14]。溶菌酶在植物、動物和微生物中被普遍的發(fā)現(xiàn)，同時它也是一種對機體無毒害、安全性能很高的堿性小分子蛋白，可以選擇性地分解植物及微生物細胞壁，并且對沒有細胞壁的人體不會產(chǎn)生降解，目前被普遍應用于食品、飼料和醫(yī)藥行業(yè)。

超深淵是指在6 000 m以下的深淵帶中凹陷深度最大的地帶，主要是一系列復雜的海溝組成，目前世界上被發(fā)現(xiàn)的獨立的超深淵棲息地有46個。超深淵底部的水溫在1～4 ℃；底部靜水壓力在600～1 100 Pa之間；物種的數(shù)量和多樣性非常低，其中最常見的是端足類、海參類多毛類、腹足類和雙殼類。超深淵海溝這種高壓、低溫、黑暗及寡營養(yǎng)的環(huán)境條件使得深海形成了特有的生命現(xiàn)象，由于這種特有環(huán)境條件使其成為一個擁有巨大潛力的生物資源寶庫[15]。鉤蝦Eurythenesgryllus又是超深淵最具有代表性物種之一，目前對它的研究還比較少，尤其在分子生物學方面[16]。本研究從E.gryllus克隆表達一個含有失穩(wěn)酶結構域的i型溶菌酶，成功表達和純化出較高濃度的表達產(chǎn)物，以期為該蛋白后續(xù)生物活性及功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鉤蝦E.gryllus采集于雅浦海溝(11°20.0′N, 142°11.5′E, 5 970 m)。采集后的樣品放置在RNAlater保護液中，并于-80 ℃保存。

pET-His vector、EscherichiacoliTOP10菌株和E.coliBL21菌株為本實驗室保存；DNAase I、RNAase inhibitor、BamH I、EcoR I、PrimerSTAR、Reverse Transcriptase M-MLV、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、His標簽蛋白純化試劑盒購買自GE公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1E.gryllus總RNA提取和cDNA合成 按照TRIzol Reagent說明書操作步驟提取組織中的總RNA，經(jīng)電泳檢測無降解后，取RNA 2 μg，加入Oligo(dT)18引物1 mm3，加入DEPC-H20配制到13.5 mm3。70 ℃保溫10 min后，迅速在冰上放置2 min。短暫離心數(shù)秒后，加入5×M-MLV buffer 4 mm3，10 mmol/dm3dNTP mixture 1 mm3，Reverse Transcriptase M-MLV 1 mm3，RNAase inhibitor 0.5 mm3。混勻后42 ℃保溫1 h。70 ℃保溫15 min后，冰上冷卻，得到cDNA，可用于PCR擴增。

1.2.2 生物信息學分析 根據(jù)實驗室前期測定的E.gryllus轉錄組，我們獲得了其溶菌酶的全長序列，命名為基因EgLyz。將獲得的基因EgLyz用DNAMAN確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列。利用NCBI(美國國家生物技術信息中心)服務器，BLAST比對分析基因EgLyz核酸序列和氨基酸序列；利用SignalP 4.1分析信號肽及切割位點；利用ProtParam預測序列分子式、分子量和等電點；通過Pfam數(shù)據(jù)庫的搜索及SMART軟件在線分析蛋白結構域組成；用Predict Protein(https://www.predictprotein.org/)進行空間結構中二硫鍵及其位置的預測；將獲得的E.gryllus溶菌酶氨基酸序列和其他動物不同類型溶菌酶序列進行比較，然后用MEGA程序中鄰接法作出溶菌酶的分子系統(tǒng)進化樹，節(jié)點上的數(shù)字表示1 000次復制的自展值，用于檢驗所計算的進化樹分支可信度。

1.2.3EgLyz基因克隆 根據(jù)基因EgLyz的開放閱讀框除去信號肽序列后設計特異性PCR擴增正反引物，正向引物：5′-CGGGATCCCAAGACTCCACCTGTCTAGGGTG-3′(下劃線表示BamH I酶切位點)；反身引物：5′-CGGAATTCTCACCCTGTAGCAGCTGTCAACACG-3′(下劃線為EcoRI酶切位點)。在50 mm3反應體系中加入cDNA模板量為100 ng, 10 mm35×Primerstar Buffer(含Mg2+)，4 mm3dNTP(2.5 mmol/dm3)，0.5 mm3正向引物F(20 μmol/dm3)，0.5 mm3反向引物R(20 μmol/dm3), 0.5 mm3Primerstar HS DNA Polymerase(2.5 U/dm3)，剩余用H2O補齊至總體積50 mm3。PCR反應條件為：98 ℃先預變性1 min；98 ℃再變性10 s；之后58 ℃退火30s；72 ℃延伸1 min，總共30個循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 重組質粒pET-His-EgLyz構建及鑒定 上述PCR產(chǎn)物回收后利用BamH I和EcoR I對產(chǎn)物及pET-His進行雙酶切。用瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產(chǎn)物分離，之后利用DNA膠回收試劑盒分別對EgLyz基因片段和pET-His載體進行回收。將兩者16 ℃連接過夜(12～16 h)。構建好的重組表達質粒命名為pET-His-EgLyz。然后將連接產(chǎn)物轉化到E.coliTOP10中，在超凈工作臺中涂布到具有氨芐抗性的固體培養(yǎng)皿上，挑取陽性單菌落進行測序，對測序結果進行分析。

1.2.5 重組質粒pET-His-EgLyz表達 將構建好的重組質粒pET-His-EgLyz轉化至E.coliBL21 中，挑取單菌落接種到5 cm3含有氨芐抗性(1∶1 000)的LB液體培養(yǎng)基中(10 g/dm3胰蛋白胨，10 g/dm3NaCl，5 g/dm3酵母提取液)，在37 ℃搖床中培養(yǎng)過夜12 h左右，次日取0.5 cm3液體培養(yǎng)基接種到含有氨芐抗性的250 cm3的LB培養(yǎng)基中(1∶1 000)，37 ℃震蕩培養(yǎng)2 h后(吸光度為0.6～0.8)，取出1 cm3作為誘導前對照，然后加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/dm3，在搖床中誘導表達5 h。用質量分數(shù)為12%的SDS-PAGE電泳鑒定誘導前后樣品。

1.2.6 重組質粒pET-His-EgLyz表達純化 收集上述誘導表達后的菌體使用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/dm3NaH2PO4，0.1 mol/dm3Na2HPO4，pH 7.4)重懸，在冰浴條件下對收集的菌體懸浮液進行超聲破碎(超聲破碎參數(shù)：工作5 s，間隙20 s，全程時間30 min，功率200 W左右)。13 000 r/min離心10 min，將所得上清和包涵體沉淀收集起來，用裂解液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，8 mol/dm3尿素，pH7.4)重懸包涵體，懸浮液置于室溫下孵育過夜。次日于13 000 r/min離心10 min，并收集上清溶液，再與His標簽蛋白純化介質在4 ℃條件下孵育結合3h。去除上清液后，再用含有0.02 mol/dm3咪唑的洗脫液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，8 mol/dm3尿素，pH 7.4)進行漂洗，最后用含有不同咪唑濃度的洗脫液把目的蛋白從介質上洗脫下來并收集。

將純化好并且條帶單一的目的蛋白轉移到透析袋中，在4 ℃條件下依次用含有6.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.00 mol/dm3尿素磷酸緩沖液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，pH 7.4)進行透析復性。復性成功后，將目的蛋白留樣進行SDS-PAGE電泳鑒定，剩余保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 蛋白質印跡法檢測重組蛋白 純化或復性樣品電泳結束后，取出凝膠放置于濾紙上，PVDF膜置于凝膠上層，之后放置于預冷電轉緩沖液中，于4 ℃冰箱中300 mA下電轉1 h；取出PVDF膜，置于含5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1 h;加入封閉液稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，再用封閉液稀釋的二抗室溫孵育1 h，再漂洗3次，之后與化學發(fā)光底物反應5 min，暗室曝光顯影至出現(xiàn)顏色深度適宜的條帶。

2 結果與分析

2.1 EgLyz cDNA全長序列的特征分析

EgLyz該基因全長987 bp，5′非編碼區(qū)為234 bp，3′非編碼區(qū)為246 bp，其完整的閱讀框架為507 bp，編碼168個氨基酸。經(jīng)SignalP 4.1分析，前34個氨基酸為信號肽，從而可以判斷其可分泌到胞外。去除信號肽后，成熟肽是由134個氨基酸組成(圖1)。ProtParam分析結果表明EgLyz基因成熟肽的相對分子質量為14.5 kDa，理論等電點為5.58。經(jīng)SMART分析，該基因具有一個失穩(wěn)酶結構域(36～159 aa)。Predict Proten軟件分析表明EgLyz基因含有13個半胱氨酸殘基，已檢測到1對(Cys56 和 Cys159)二硫鍵，而二硫鍵在維持蛋白構象及活性方面起到重要作用[17]。

圖1 E.gryllus溶菌酶基因 EgLyz核苷酸序列及其氨基酸序列

通過NCBI對基因EgLyz序列同源性進行比對分析，結果表明基因EgLyz與數(shù)據(jù)庫中已知同源序列相似性都比較低，與果蠅(Drosophilagrimshawi)溶菌酶同源相似性序列最高達到62%，與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)溶菌酶一致性達到56%，與克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)一致性為50%。進一步，根據(jù)基因庫中已經(jīng)報道的凡納濱對蝦、克氏原鰲蝦(Procambarusclarkia)、青蟹(Scyllaparamamosain)及其他生物包含的溶菌酶序列，利用MEGA軟件建立溶菌酶的進化樹。從構建的系統(tǒng)進化樹結果可以看出，溶菌酶在不同動物體內(nèi)可以分為3大組，第一組屬于節(jié)肢動物體內(nèi)的溶菌酶；第二組為貽貝、鮑魚等軟體動物的溶菌酶；第三組為老鼠、牛等脊椎動物的溶菌酶?；駿gLyz與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)等節(jié)肢動物的溶菌酶聚為一支(圖2)。

圖2 不同生物體內(nèi)溶菌酶的系統(tǒng)進化樹

2.2 pET-His-EgLyz重組質粒的構建

根據(jù)基因序列設計引物，對EgLyz基因進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物后，能在500 bp左右看到一條非常單一、特異性很高的條帶，與實際目的片段大小相符(圖3)。

圖3 E.gryllus 中溶菌酶基因克隆

將擴增后得到的EgLyz基因與pET-His 連接，構建重組表達質粒pET-His-EgLyz。轉化TOP10，挑取單菌落做菌落PCR，挑取目的大小正確的陽性克隆子送測序分析。測序結果表明，我們成功構建了重組表達質粒pET-His-EgLyz。

2.3 EgLyz的重組表達與純化

將重組表達質粒pET-His-EgLyz轉化E.coliBL21中，當OD600在0.6～0.8后，加入IPTG誘導5h，結果顯示能夠較明顯地表達目的蛋白，進一步破碎后分析表明，大量表達的重組蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)。

在此基礎上，利用融合的His 標簽對目的蛋白進行純化，可以看到用分別含有0.2 mol/dm3和0.3 mol/dm3咪唑的兩種洗脫液能洗脫出濃度比較高的目的蛋白(圖5a)。但是在35 kDa左右的位置也有一條比較弱的單一條帶，經(jīng)Western blot 分析為二聚體條帶(圖5b)。

圖4 pET-His-EgLyz誘導后重組表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析結果

圖5 SDS-PAGE電泳分析EgLyz的純化結果

隨后在尿素變性的條件下，通過逐漸降低緩沖液中尿素濃度的方法，對純化的蛋白進行透析，使尿素濃度逐漸減少到0。蛋白在透析袋復性成功后，SDS-PAGE電泳分析檢測結果顯示目的蛋白能夠較好地溶解在緩沖液中，并且在15 kDa左右能夠看到一條單一的條帶，條帶大小與預測EgLyz基因大小相符(圖6)。

圖6 Western blot 分析EgLyz復性產(chǎn)物

2.4 討論

溶菌酶是一種天然的蛋白質，作為營養(yǎng)物質可以被人體胃腸消化和吸收，并且不會殘留和產(chǎn)生毒害作用，因此被廣泛的應用在食品和醫(yī)學上。在食品方面主要是作用于各種食品如水產(chǎn)品類熟制品、肉類制品的防腐和保鮮；在醫(yī)學上，溶菌酶作為酶類抗菌藥，能參與粘多糖代謝。已有報道，在診斷白血病方面，只要檢查病患者的尿或者血清中溶菌酶活性，就可以確診[18]。在構成機體非特異性免疫功能方面，溶菌酶也是重要的因素之一，因此溶菌酶在體育方面發(fā)揮著重要作用，根據(jù)俄羅斯巴.戈托夫米夫的報道，他認為運動員在良好狀態(tài)時，其唾液溶菌酶的滴度值下降，因此溶菌酶可以用來對運動員身體進行評定[19]。而在科研上，溶菌酶作為工具酶在基因工程及細胞工程方面也發(fā)揮著重要作用，可以用來生產(chǎn)和提取菌體的活性物質如酶、核酸和活性多肽等[20]。因此，各方面來說溶菌酶都具有廣闊的應用前景。由于溶菌酶作用特異性比較強，并且每個類型的溶菌酶最適的反應條件都不同，所以開發(fā)新型溶菌酶就顯得至關重要。

雅浦海溝存在于地球上的典型的極端環(huán)境，其獨特的環(huán)境條件會使得在這里生存的生物都具有一些特殊的生物活性分子，因此該極端環(huán)境中可能蘊含龐大的基因資源庫，具有巨大的潛在應用價值。

3 結論

本研究以深海鉤蝦E.gryllus為材料，首次從E.gryllus中克隆獲得i型溶菌酶基因EgLyz。近年由于對超深淵生物研究比較少，深海生物的基因資源庫還存在嚴重缺失，因此基因EgLyz序列分析與已知序列相似性較低，最大相似度與果蠅(Drosophilagrimshawi)也只有62%，因此EgLyz可能是一個新穎的溶菌酶蛋白。EgLyz含有一個失穩(wěn)酶結構域，13個半胱氨酸殘基，已檢測到1對二硫鍵，因此蛋白構象非常穩(wěn)定。

通過克隆，EgLyz基因成功進行了原核重組表達，并且在復性時對復性條件不斷進行優(yōu)化，最終獲取了無其他雜蛋白較高純度的可溶性表達產(chǎn)物，本研究實驗結果為下一步EgLyz基因生物活性及功能分析奠定了堅實的基礎，也豐富了i 型溶菌酶基因資源，這將為E.gryllus在深海這種極端環(huán)境中的適應機制的研究提供幫助。