黃芪多糖對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

孫林浩，程安怡，黃小紅，張偉妮,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院，福建 福州，350002)

大黃魚(Larimichthyscrocea)俗稱黃花魚，屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬(Larimichthys)，是我國(guó)獨(dú)特的海水魚種。目前，大黃魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量十余萬噸，產(chǎn)值超百億元。然而，養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化造成了大面積疾病的爆發(fā)，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，已成為制約大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸之一[1]。對(duì)于大黃魚養(yǎng)殖病害的防治，目前主要采用抗生素和化學(xué)藥物。但是抗生素和化學(xué)藥物的大量使用，造成了魚體藥物殘留、病原菌耐藥性增加及環(huán)境污染等嚴(yán)重問題。因此，尋找能有效防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病、替代或減少抗生素使用的免疫增強(qiáng)劑顯得非常必要。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效[2]。黃芪中含有多種活性成分，包括黃芪黃酮類、黃芪皂苷、黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide, APS)等。其中，黃芪多糖為黃芪中最主要的活性成分之一，在提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血糖等方面具有顯著效果[3]，現(xiàn)在多應(yīng)用于中醫(yī)臨床和動(dòng)物疾病的預(yù)防[4]。同時(shí)，APS在提高和改善水生動(dòng)物免疫功能方面的作用也受到普遍關(guān)注。許明等(2008)發(fā)現(xiàn)在草魚飼料中添加適量的APS、維生素K3粉和維生素C，可提高草魚對(duì)病毒的抵抗力，達(dá)到治療草魚出血病的效果[5]。在飼料中添加1 200 mg/kg的APS可以顯著促進(jìn)黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)各組織中的溶菌酶活力和吞噬細(xì)胞的吞噬能力，提高魚體對(duì)遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)的免疫保護(hù)力[6]，并顯著促進(jìn)外周血白細(xì)胞的增殖[7]。

頭腎是硬骨魚類的主要免疫器官，也是主要造血器官，是免疫細(xì)胞的發(fā)生場(chǎng)所，在功能上類似于高等脊椎動(dòng)物的脊髓[8-9]。頭腎中的巨噬細(xì)胞在識(shí)別與吞噬外來病原微生物、處理和呈遞抗原、激活淋巴細(xì)胞啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其活性與功能是反映和評(píng)價(jià)魚類免疫水平的重要指標(biāo)[10-11]。本研究以大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，初步研究APS對(duì)大黃魚巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)、吞噬活性及免疫相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響，明確APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的激活作用，有利于進(jìn)一步研究APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚 大黃魚來自寧德海水養(yǎng)殖基地，體長(zhǎng)(25±5)cm，體重(400±100)g。

1.1.2 主要試劑 黃芪切片購(gòu)自北京同仁堂健康藥業(yè)有限公司；GIBCO Leibovitz′s L-15 無酚紅培養(yǎng)基、GIBCO胰酶、FITC-熒光微球購(gòu)自Thermo公司；Percoll購(gòu)于GE公司；丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、脂多糖(LPS)購(gòu)于sigma公司；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、DAF-FM DA(NO熒光探針)購(gòu)自碧云天公司；紅細(xì)胞裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、Go Taq? qPCR Master Mix 購(gòu)于Promega公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪多糖提取 采取水提醇沉法[12]從黃芪切片中制得粗糖。采用酶-Sevag法進(jìn)一步去除蛋白。最后經(jīng)AB-8大孔樹脂柱(柱體積為200 cm3)純化，將洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到純化的APS。用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖含量為78%。

1.2.2 大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的分離 大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的分離采取Percoll密度梯度離心技術(shù)，選取健康大黃魚，MS-222麻醉大黃魚至不動(dòng)，隨后將其放置于解剖盤中，用75%的酒精擦拭魚體，殺死魚體表細(xì)菌。抽盡魚血，用剪刀和鑷子取出大黃魚頭腎。在超凈臺(tái)內(nèi)研磨，研磨液過70 μm濾網(wǎng)，后將濾過液加入到事先配制好的體積分?jǐn)?shù)分別為34%與51%的Percoll分離液液面之上。4 ℃、2 248 r/min離心30 min，得液面交界處細(xì)胞。加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋后按每孔2 cm3加至6孔板中。每孔細(xì)胞濃度為2×106cells/cm3。貼壁2 h后，用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去懸浮與半貼壁的細(xì)胞，用無酚紅的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)備用。

1.2.3 氧呼吸爆發(fā)(ROS)的檢測(cè) 備用的細(xì)胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將細(xì)胞置于28 ℃培養(yǎng)24 h，隨后每孔加入0.1 μg/cm3PMA，刺激1 h后棄去培養(yǎng)基，加入10 μmol/dm3的DCFH-DA(用無血清培養(yǎng)液按體積比為1∶1 000稀釋)。28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入胰酶700 mm3消化細(xì)胞5 min，棄去胰酶，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 氮呼吸爆發(fā)(NO)的檢測(cè) 備用的細(xì)胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將細(xì)胞置于28 ℃培養(yǎng)24 h。處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，加入5 μmol/dm3的DAF-FM DA(用DAF-FM DA稀釋液按體積比為1∶1 000稀釋)。28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入700 mm3胰酶消化細(xì)胞5 min，棄去胰酶，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 APS對(duì)LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活性檢測(cè) 備用的細(xì)胞分別用含0、50、100、200、400、800 μg/cm3APS的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將細(xì)胞置于28 ℃培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，加入 LPS濃度為20 μg/cm3的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后，在每個(gè)孔內(nèi)加入1 mm3FITC-熒光微球，28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)1 h。用PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入胰酶700 mm3消化細(xì)胞5 min，棄去胰酶，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，PBS清洗后用100 mm3PBS重懸，避光置于冰上，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá) 將大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞用200 μg/cm3的APS處理，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。于處理后6、12、24 h時(shí)按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒操作說明收集細(xì)胞RNA。用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按Promega公司生產(chǎn)的Go Taq? qPCR Master Mix 進(jìn)行。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到各樣品的Ct值后，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)樣品Ct值作均一化處理，通過2-△△Ct計(jì)算各個(gè)樣品mRNA相對(duì)含量。TNF-α上游引物：5′-GGACGATTCTTCGTTTACAG-3′，下游引物：5′-GTTTGTCACCTCTGTTCAGG-3′；IL-1β上游引物：5′-CAGCTGTTCTCAAGTATGTGGC-3′，下游引物：5′-GTTGTAAATAGTGGGTGTGTCG-3′；IL-6上游引物：5′-GCTGTTCTCAAGTATGTGGCG-3′，下游引物：5′-TGTTGTAAATAGTGGGTGTGTCG-3′；β-actin上游引物：5′-GACCTGACAGACTACCTCATG-3′，下游引物：5′-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGGA-3′，3條魚重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，用LSD判定組間的差異性，用FlowJo軟件對(duì)流式細(xì)胞儀測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)影響

如圖1a所示，隨著APS濃度的增加，DCFH-DA的熒光強(qiáng)度明顯下降，且呈劑量依賴性。通過對(duì)其平均熒光值進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖1b所示，50、100、200、400、800 μg/cm3APS均可極顯著地抑制活性氧的產(chǎn)生(p<0.01)。

圖1 不同濃度APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)的影響

2.2 氮呼吸爆發(fā)的檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)的影響，結(jié)果如圖2a所示，與Ⅰ峰相比(空白)，各峰逐漸向其左方偏移，且偏移程度隨APS濃度增大而增大。通過對(duì)其平均熒光值進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖2b所示，不同濃度APS作用大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞24 h后，100 μg/cm3APS能夠顯著地抑制細(xì)胞NO的產(chǎn)生(p<0.05)，200、400、800 μg/cm3的APS能夠極顯著地抑制細(xì)胞NO的產(chǎn)生(p<0.01)，且呈劑量依賴性。50 μg/cm3APS與空白組相比無顯著性差異。

圖2 不同濃度APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)的影響

2.3 APS對(duì)經(jīng)LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

頭腎巨噬細(xì)胞具有吞噬熒光微球的能力，如圖3a所示，峰越往右表示其吞噬微球數(shù)目增多。用50、100、200 μg/cm3APS 預(yù)處理24 h后發(fā)現(xiàn)，與Ⅱ峰(LPS刺激)相比，熒光強(qiáng)度明顯升高，則說明細(xì)胞吞噬熒光微球數(shù)量增多，400、800 μg/cm3APS處理組與Ⅱ峰相比差異不明顯。通過對(duì)其平均熒光值進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖3b所示，50、100 μg/cm3的APS預(yù)處理24 h后可以極顯著地增強(qiáng)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞經(jīng)過LPS刺激后的吞噬能力(p<0.01)，200 μg/cm3APS可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后的吞噬能力(p<0.05)，400、800 μg/cm3APS刺激后與單純 LPS刺激組相比無顯著性差異。

圖3 不同濃度APS對(duì)經(jīng)LPS刺激大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

2.4 RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)

APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響如圖4所示，在采用200 μg/cm3的APS刺激大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞后，3種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平在6、12、24 h均極顯著上升(p<0.01)，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA轉(zhuǎn)錄水平在6 h升高最明顯，隨著刺激時(shí)間增長(zhǎng)，升高趨勢(shì)逐漸降低。

圖4 APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)水平影響

2.5 討論

頭腎是大黃魚免疫細(xì)胞的主要發(fā)源地之一，這些免疫細(xì)胞包括單核/巨噬細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等，其中頭腎巨噬細(xì)胞在魚類抵御微生物感染的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用[13]。多糖是一種重要的生物大分子，在機(jī)體內(nèi)參與各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)和能量的儲(chǔ)存與傳遞[14-16]。研究表明，植物多糖可以通過激活免疫細(xì)胞、活化補(bǔ)體、促進(jìn)細(xì)胞因子生成等方面對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[17]。

氧是細(xì)胞發(fā)揮作用所必不可少的成分，但氧過量時(shí)會(huì)發(fā)生單價(jià)還原而產(chǎn)生活性氧類。活性氧是指機(jī)體在進(jìn)行生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，大部分細(xì)胞中90%以上的氧在線粒體中被消耗，其中約2%的氧在線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)中被轉(zhuǎn)變成為活性氧?；钚匝踔饕ǎ撼蹶庪x子、單線態(tài)氧、次氯酸、羥自由基、過亞硝酸鹽、過氧化氫等?；罨木奘杉?xì)胞會(huì)產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，消耗大量的氧同時(shí)產(chǎn)生過量的活性氧自由基。過量的活性氧會(huì)損害細(xì)胞正常的雙層膜結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞，繼而損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子，最終導(dǎo)致自身凋亡[18]。李明春等(2000)發(fā)現(xiàn)靈芝多糖GLB7可以減少小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的生成，清除活性氧，從而達(dá)到免疫增強(qiáng)與抗衰老的目的[19]。張慶等(2000)也發(fā)現(xiàn)大棗中性多糖具有抗活性氧作用，減少其對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的損傷作用[20]。本研究通過用APS對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞處理24 h后發(fā)現(xiàn)，不同濃度APS均可以顯著抑制頭腎巨噬細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后的氧呼吸爆發(fā)活性。

本研究結(jié)果表明，APS還可以抑制頭腎巨噬細(xì)胞的氮呼吸爆發(fā)活性，抑制效果隨濃度增加而增加。NO是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)分子之一，它是由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生。適量的NO可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能，但是過量的NO會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，損傷細(xì)胞、導(dǎo)致基因突變。歐德淵等(2007)研究顯示APS可以使仔豬腹腔巨噬細(xì)胞中NO的含量顯著降低[21]，與本研究結(jié)果一致。

巨噬細(xì)胞的吞噬功能是其最主要的細(xì)胞功能，是其識(shí)別并消滅病原體、清除衰亡細(xì)胞、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要手段。本研究結(jié)果顯示，50、100、200 μg/cm3APS可以顯著增強(qiáng)LPS刺激的大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活性，說明APS預(yù)處理可以通過提高大黃魚頭腎巨噬的吞噬活性來提高機(jī)體對(duì)病原菌的免疫力。

已有研究表明，APS可以增強(qiáng)豬外周血樹突狀細(xì)胞IL-1β和TNF-α的表達(dá)量，并顯著增強(qiáng)IL-6的表達(dá)量[22]。曹麗萍等(2008)在對(duì)鯉魚頭腎巨噬細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)，APS能顯著增強(qiáng)IL-1β的表達(dá)量[23]。TNF-α、IL-1β、IL-6是巨噬細(xì)胞分泌重要的細(xì)胞因子，是其發(fā)揮免疫功能必不可少的活性物質(zhì)[24]。在本研究中，200 μg/cm3的APS能夠顯著增強(qiáng)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達(dá)，說明APS可以通過增強(qiáng)細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

本研究表明APS可以抑制大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性，增強(qiáng)經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞的吞噬活性，提高巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表達(dá)量，從而對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。