白細(xì)胞介素-6抑制劑對銀屑病模型大鼠背部皮膚組織的影響及作用機(jī)制

魏榮 吳斌 呂靜

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院皮膚科，湖北 宜昌 443001)

銀屑病是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、免疫反應(yīng)異常所引起的慢性炎癥性皮膚病，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為鱗屑性紅斑〔1〕。目前臨床上銀屑病的流行病學(xué)調(diào)查顯示，受多種基因的連鎖影響，銀屑病發(fā)生后較易引起代謝綜合征、心血管疾病、糖尿病、高血壓等多系統(tǒng)疾病，且認(rèn)為上述并發(fā)癥的嚴(yán)重程度與銀屑病的嚴(yán)重程度有關(guān)〔2〕。有研究表明〔3〕，銀屑病患者機(jī)體T淋巴細(xì)胞、免疫反應(yīng)異常與白細(xì)胞介素(IL)-6的異常表達(dá)有關(guān)，IL-6在銀屑病患者血清中為高表達(dá)，IL-6可對中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等具有較強(qiáng)的趨化作用，最終導(dǎo)致血管周圍發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤。由于銀屑病較為頑固難治、較易復(fù)發(fā)，臨床上常規(guī)治療此病的效果并不理想，目前已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)重大疑難病之一，嚴(yán)重影響著患者的正常生活〔4〕。本研究旨在觀察IL-6抑制劑對銀屑病模型大鼠背部皮膚組織的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選擇SD健康大鼠30只(SPF級)，由基爾頓生物科技(上海)有限公司提供。鼠齡3～6個月，平均(3.8±1.5)個月；體重200～250 g，平均(220±7.9)g；飼養(yǎng)溫度為22～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許它們自由活動，飼養(yǎng)時間為1 w。本研究所做實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑：IL-6抑制劑(北京白奧萊博科技有限公司，貨號M07110)；Trizol(美國Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(均購于天根生化科技(北京)有限公司，貨號：DP422、KR103、KT109)。

1.2分組及建模 將30只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、銀屑病組和IL-6抑制劑組各10只，參照高揚(yáng)等〔5〕研究實驗中銀屑病模型建立方法建立銀屑病大鼠模型，將所有大鼠背部中央2 cm×4 cm的毛發(fā)區(qū)處的毛發(fā)全部剃除，之后按照0.05 g/cm2的標(biāo)準(zhǔn)將藥膏均勻涂抹至剃除的毛發(fā)區(qū)，空白對照組大鼠剃除的毛發(fā)區(qū)均勻涂抹凡士林乳膏，銀屑病、IL-6抑制劑組大鼠剃除的毛發(fā)區(qū)均勻涂抹咪喹莫特乳膏，每日1次，共涂抹14 d。若在建模過程中大鼠背部中央毛發(fā)區(qū)再次長出毛發(fā)，重復(fù)進(jìn)行脫毛處理。

1.3給藥 建模成功后，IL-6抑制劑組大鼠腹腔注射5 mg/kg IL-6抑制劑，空白對照組、銀屑病組腹腔注射等劑量的生理鹽水，4 w注射1次，共注射3次，在對大鼠最后一次給藥后2 d觀察大鼠變化。

1.4背部皮膚組織樣本采集 給藥結(jié)束后，采用斷頭法處死3組大鼠，取大鼠背部皮膚組織分為兩份，其中1份在10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備石蠟切片，測定大鼠背部皮損表皮厚度、Baker病理評分、炎性細(xì)胞計數(shù)及蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理組織學(xué)病變情況。另一份液氮冷凍保存，作后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.5HE染色及背部皮損表皮厚度檢測 將所制備的大鼠背部皮損組織在10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，之后脫水、透明，待封片晾干后再顯微鏡下觀察大鼠背部皮損組織病理學(xué)表現(xiàn)。采用IPP6.0軟件測量表皮厚度。

1.6Baker病理評分、炎性細(xì)胞計數(shù) ①Baker病理評分標(biāo)準(zhǔn)。角質(zhì)層：2分：出現(xiàn)小膿瘍；1分：角化不完全；0.5分：過度角化計。表層：1分：表層中見有顆粒細(xì)胞層消失；1分：棘層肥厚。真皮層：5分：毛細(xì)血管擴(kuò)張；出現(xiàn)單一多核細(xì)胞浸潤，根據(jù)嚴(yán)重程度分為重度、中度、輕度，分別計為2分、1分、0.5分。②炎性細(xì)胞計數(shù)。Baker病理評分完成后，使用光學(xué)顯微鏡對大鼠背部皮膚組織進(jìn)行攝片，采用Imagepro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)對所選視野中的炎性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.7背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平檢測 取液氮冷凍保存的大鼠背部皮膚組織，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測，將采集到的標(biāo)本，取包被液〔pH9.5 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(CB)〕適當(dāng)稀釋的抗IL-17、IL-22、IL-23 0.1 ml，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，加蓋后溫度4℃ 24 h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1 ml，同時加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，在43℃置60 min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入IL-17、IL-22、IL-23的酶標(biāo)抗體0.1 ml，43℃置60 min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個空中加入底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml,0.05 mol/L枸櫞酸(10.5 g/L)4.86 ml混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中,臨用時加30% H2O24.0 μl,混勻0.1 ml，黑暗環(huán)境下放置20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。分析IL-17、IL-22、IL-23水平。

1.8背部皮膚組織中IL-6受體/Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(IL-6R/JAK/STAT3)通路因子mRNA表達(dá)量檢測 取液氮冷凍保存的大鼠背部皮膚組織，加入1 ml Trizol研磨為粉末狀，按照制備試劑盒說明書提取大鼠背部皮膚組織中總RNA，之后對RNA純度、含量進(jìn)行檢測，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer5.0軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計，使用RT-PCR方法檢測大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5 mRNA表達(dá)量。IL-6R引物序列：上游：5′-CATGTGCGTCGCCAGTAGT-3′，下游：5′-AGCTCAAACCGTAGTCTGTAGA-3′；JAK1引物序列：上游：5′-AGTGCCCTGAGCTACTTGGA-3′，下游：5′-AGGTCAGCCAGCTCCT-3′；STAT3引物序列：上游：5′-ATCACGCCTTCTACAGACTGC-3′，下游：5′-CATCCTGGAGATTCTCTACCACT-3′；CD80引物序列：上游：5′-AAACTCGCATCTACTGGCAAA-3′，下游：5′-GGTTCTTGTACTCGGGCCATA-3′；CCL5引物序列：上游：5′-GCAAGGAGACCACCAACAG-3′，下游：5′-CCCTCACTTCCAACCCAAATC-3′；β-actin引物序列：上游：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠一般情況觀察 空白對照組大鼠背部備皮區(qū)皮膚始終為淡紅色的光滑皮膚，無鱗屑、紅斑、糜爛癥狀出現(xiàn)。銀屑病組大鼠背部皮區(qū)皮膚在建模后的第2天開始出現(xiàn)厚層銀白色鱗屑和浸潤性紅斑癥狀，少量的大鼠出現(xiàn)出血點(diǎn)，且隨著時間的推移，鱗屑、紅斑癥狀逐漸加重。IL-6抑制劑組大鼠背部皮區(qū)皮膚鱗屑、紅斑癥狀逐漸減輕、消退，逐漸恢復(fù)至正常。見圖1。

圖1 3組大鼠背部皮膚變化

2.23組大鼠病理組織學(xué)觀察 空白對照組大鼠角質(zhì)層較薄，顆粒層為2～4層，棘層大為2～3層。銀屑病組大鼠顆粒層較為肥厚、顆粒層減少、存在少量的中性白細(xì)胞聚集、皮突下延呈杵狀、真皮乳頭上延，存在組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血。IL-6抑制劑組大鼠表皮變薄，角化過度、角化不全基本消失，顆粒層增多，組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤、真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血等癥狀表現(xiàn)顯著減輕，基本恢復(fù)正常。見圖2。

圖2 3組大鼠病理組織學(xué)HE染色觀察圖(×100)

2.33組大鼠Baker評分、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)、表皮厚度比較 銀屑病組、IL-6抑制劑組大鼠Baker評分、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)、表皮厚度均明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6抑制劑組大鼠Baker評分、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)、表皮厚度均明顯低于銀屑病組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠Baker評分、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)、表皮厚度比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與銀屑病組比較：2)P<0.05，下表同

2.43組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平比較 銀屑病組、IL-6抑制劑組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6抑制劑組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平均明顯低于銀屑病組(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23表達(dá)水平比較

2.53組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA水平比較 銀屑病組、IL-6抑制劑組大鼠背部皮膚組織中IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5 mRNA表達(dá)量均明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6抑制劑組大鼠背部皮膚組織中IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5mRNA表達(dá)量均明顯低于銀屑病組(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA表達(dá)量比較

3 討 論

銀屑病的病理機(jī)制尚不完全明確，但就目前研究來看銀屑病與病灶內(nèi)異常浸潤的T淋巴細(xì)胞及其所產(chǎn)生的炎癥因子有關(guān)，當(dāng)T淋巴細(xì)胞表面受體與炎癥因子結(jié)合后會引起受體活化，之后沿著其特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)移動至細(xì)胞核中，對目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生啟動作用，最終發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能〔6,7〕?；罨男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)通路在銀屑病炎癥、免疫應(yīng)答過程中有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔8〕。目前有研究認(rèn)為MAPK、NF-κB、Notch、IL-6R/JAK/STATs、Wnt等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展〔8,9〕。而IL-6在銀屑病發(fā)生后出現(xiàn)高表達(dá)，其生物學(xué)功能主要是通過與IL-6R相結(jié)合后形成異源二聚體，之后再在gp130上結(jié)合，形成具有高親和力的復(fù)合物IL-6/IL-6R/gp130，最終作用于IL-6R/JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動或者加重銀屑病〔10〕。

IL-6發(fā)揮作用途徑是與IL-6R相結(jié)合后對JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行激活，對其特定基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，因此認(rèn)為IL-6是否會產(chǎn)生其特性的生物學(xué)效應(yīng)與IL-6R表達(dá)水平的高低有關(guān)〔11〕。IL-6R/JAK/STAT3屬于一種由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)JAK/STAT通路被激活后其通路因子STAT3會對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響〔12〕。STAT3的活化主要是通過STAT3分子酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化后所實現(xiàn)的，當(dāng)發(fā)生磷酸化的STAT3形成二聚體后會進(jìn)入至細(xì)胞核中了，之后通過其信號識別作用與其下游靶基因的啟動子進(jìn)行特異性的結(jié)合，最終對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)〔13〕。IL-6R/JAK/STAT3的下游靶基因包括CD80、CCL5。其中CD80屬于一種活化T淋巴細(xì)胞所必需的共刺激因子，當(dāng)兩者協(xié)同作用刺激信號較強(qiáng)時，會對自身反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生激活作用，進(jìn)而引起自身免疫反應(yīng)、機(jī)體損傷等，導(dǎo)致繼發(fā)性的角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生過度增生作用〔14〕。有研究表明〔15〕，T淋巴細(xì)胞在遷移至銀屑病皮損處前已經(jīng)被激活，而銀屑病患者淋巴細(xì)胞中CD80為高表達(dá)，與患者疾病的發(fā)生呈正相關(guān)。

CCL5為IL-6R/JAK/STAT3的另一種下游靶基因，屬于CC類亞族趨化因子家族中的主要成員，在人體組織中廣泛存在，可調(diào)節(jié)正常活化的T細(xì)胞的表達(dá)和分泌蛋白；CCL5一方面可對淋巴細(xì)胞遷移、歸巢產(chǎn)生介導(dǎo)作用，另一方面可引發(fā)白細(xì)胞的遷移，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，誘導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥部位浸潤〔16〕。CCL5不僅對多種細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，還可對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生激活作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和參與炎癥反應(yīng)〔17〕。在銀屑病發(fā)生后角質(zhì)形成細(xì)胞來源的CCL5高于正常皮膚，CCL5表達(dá)增強(qiáng)，其原因可能與銀屑病病灶皮損處聚集大量的活化T細(xì)胞有關(guān)〔18〕。本研究結(jié)果提示，IL-6抑制劑可能是通過作用于IL-6R/JAK/STAT3信號通路，調(diào)控其通路因子，進(jìn)而影響銀屑病病灶內(nèi)異常浸潤的T淋巴細(xì)胞及其所產(chǎn)生的炎癥因子，最終起到改善皮損病癥的目的，但目前臨床上對于IL-6抑制劑與銀屑病之間的作用關(guān)系并無研究，因此本研究結(jié)果還需后續(xù)研究實驗進(jìn)一步證實。

而IL-6R/JAK/STAT3信號通路的激活可誘導(dǎo)T-bet的表達(dá)、促進(jìn)Th1細(xì)胞因子的釋放，但同時會抑制Th17細(xì)胞因子的分泌，研究認(rèn)為IL-6R/JAK/STAT3信號通路的激活與Th1、Th17細(xì)胞共同參與銀屑病的發(fā)生〔19〕。而目前研究認(rèn)為〔20〕，由Th17細(xì)胞所分泌的IL-17、IL-22、IL-23因子水平會誘導(dǎo)角質(zhì)增生和病灶處炎癥反應(yīng)。本文結(jié)果說明，IL-6抑制劑可能是通過作用于IL-6R/JAK/STAT3信號通路，抑制Th17細(xì)胞炎癥因子的分泌，最終抑制角質(zhì)增生和病灶處炎癥反應(yīng)。

綜上，IL-6抑制劑可有效抑制銀屑病大鼠背部皮膚組織角質(zhì)增殖、炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控IL-6R/JAK/STAT3通路轉(zhuǎn)導(dǎo)因子有關(guān)。