Tiam1基因沉默對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響

丁米娜 鄧春玲 李月 樸英實 陳麗艷,

(延邊大學 1醫(yī)學院生物化學與分子生物學，吉林 延吉 133002；2腫瘤研究中心)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其具有發(fā)病隱匿、進展迅速、易轉(zhuǎn)移等特點〔1〕。據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，2014年中國胰腺癌發(fā)病例數(shù)9.22萬，位居惡性腫瘤發(fā)病第10位，死亡例數(shù)8.11萬，居于癌癥死亡第6位，嚴重威脅我國居民生命健康安全〔2〕。目前，胰腺癌的治療方法主要包括手術治療、放化療、生物治療與靶向治療〔3〕。分子靶向治療具有特異性強，靈敏度高，副作用輕等優(yōu)點，是胰腺癌治療的潛在有效治療方法。因此，尋找新型腫瘤分子標志物對胰腺癌早期診斷及靶向基因治療具有重要意義。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導因子(Tiam)1最初是在小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離鑒定得到〔4〕。有研究表明，Tiam1在腫瘤細胞的侵襲、遷移和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用〔5〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在胰腺癌組織中高表達，沉默Tiam1基因能體外抑制胰腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲〔6〕。本文旨在通過建立胰腺癌小鼠移植瘤模型，在體內(nèi)進一步研究Tiam1基因沉默對胰腺癌裸鼠移植瘤生長的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液購自美國BI公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000 購自Invitrogen公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑購于廣州銳博生物技術有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國 Millipore 公司。免疫印跡化學發(fā)光試劑(ECL Reagent)購自江蘇碧云天生物技術研究所。免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；β-actin 抗體、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體(美國Proteintech公司)，Tiam1抗體、Ki-67抗體、Slug抗體(美國Santa Cruz 公司)。裸鼠10只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，鼠齡為4～6 w，體質(zhì)量18～22 g；人胰腺癌BxPC-3細胞由延邊大學腫瘤研究中心提供。

1.2Tiam1-siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC細胞 取對數(shù)生長期細胞消化、離心，接種于6孔板中。待細胞長至50%～60%融合狀態(tài)時進行轉(zhuǎn)染處理，按照試劑盒說明書操作。分為未轉(zhuǎn)染(con)組、陰性對照(si-con)組和si-Tiam1組，轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組細胞蛋白，Western印跡檢測Tiam1沉默效果。

1.3Western印跡實驗 細胞轉(zhuǎn)染處理后，提取蛋白定量，變性，用于蛋白表達水平檢測。將樣品加入6%～8%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠電泳分離。在冰盒中轉(zhuǎn)膜65～75 min。5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗(Tiam1和β-Actin比例均為1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗(1∶3 000)常溫孵育1 h，TBST洗膜，加ECL發(fā)光液后，曝光。

1.4移植瘤小鼠模型建立 對BxPC細胞進行轉(zhuǎn)染處理后，體外常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞胰酶消化，離心，計數(shù)。用DMEM與Matrigel膠按照1∶1的比例重懸細胞，制備成濃度為5×107/ml的單細胞懸液。量取制備好的單細胞懸液5×106/100 μl在無菌條件下接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型。

1.5腫瘤生長曲線的繪制及瘤體質(zhì)量的測定 每天觀察腫瘤生長情況，待腫瘤形成后，每2 d用游標卡尺測量小鼠腫瘤的最長徑(a)和橫徑(b)，計算腫瘤體積V=a×b2/2， 繪制腫瘤生長曲線；采用頸椎脫臼法處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，對瘤體稱重并拍照觀察，將瘤體在多聚甲醛中固定后，石蠟包埋、切片，并進行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6免疫組織化學染色法 免疫組化染色試劑盒為中杉金橋 PV-9000 通用型二步法檢測試劑盒。取兩組石蠟組織3 μmol/L切片，常規(guī)脫蠟及水化，抗原修復，加一抗4℃孵育過夜；次日二抗，DAB顯色，然后HE復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片。每張切片在200倍顯微鏡下觀察拍照。

1.7統(tǒng)計方法 采用Prism6.01軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1胰腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 采用RNA干擾技術轉(zhuǎn)染處理胰腺癌BxPC-3細胞，Western印跡實驗檢測Taim1沉默效果，結(jié)果如圖1所示，與si-con組(0.577±0.076)比較，si-Tiam1組Tiam1蛋白的表達水平明顯降低(0.331±0.043,P<0.05)。將轉(zhuǎn)染處理后的胰腺癌BxPC-3細胞皮下接種于裸鼠體內(nèi)，兩組裸鼠在接種7 d后，均出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，成瘤率100%，且裸鼠生存狀態(tài)未受到明顯影響，表明成功建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型。

圖1 Western印跡實驗檢測Tiam1基因的沉默效果

2.2沉默Tiam1對小鼠移植瘤生長及瘤體質(zhì)量的影響 在細胞接種第10天開始，每2 d測量兩組移植瘤體積并繪制生長曲線，結(jié)果如圖2示，與對照組相比，si-Tiam1組的移植瘤生長明顯被抑制(P<0.05)，細胞接種32 d時，處死裸鼠，剝離移植瘤，并測量腫瘤體積和瘤體質(zhì)量。與si-con組移植瘤體積(2.21±0.51)cm3相比，si-Tiam1組移植瘤體積(1.28±0.37)cm3明顯降低(P<0.05)；si-con組、si-Tiam1組瘤體質(zhì)量分別為(1.98±0.58)g和(1.32±0.21)g，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明沉默Tiam1基因能顯著抑制胰腺癌移植瘤生長。

與si-con組比較：1)P<0.05圖2 兩組胰腺癌裸鼠皮下移植瘤成瘤生長曲線(A)與瘤體標本(B)

2.3沉默Tiam1對小鼠移植瘤組織形態(tài)結(jié)構及Ki-67的蛋白表達影響 腫瘤組織切片經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，與對照組相比，si-Tiam1組的小鼠移植瘤組織中細胞出現(xiàn)皺縮，密度降低，片狀壞死等病理學性改變(圖3)；免疫組化檢測增殖相關蛋白Ki-67的表達，結(jié)果顯示，Ki-67蛋白主要定位于細胞核， si-Tiam1組的移植瘤組織中Ki-67的表達比對照組明顯降低(圖4)，表明沉默Tiam1能抑制移植瘤組織中Ki-67的表達。

圖3 HE染色檢測沉默Tiam1對胰腺癌裸鼠移植瘤組織形態(tài)結(jié)構的影響(×200)

圖4 IHC染色檢測沉默Tiam1對胰腺癌裸鼠移植瘤組織Ki-67蛋白的影響(×200)

2.4沉默Tiam1對小鼠移植瘤組織(EMT)相關蛋白表達的影響 IHC染色檢測EMT相關蛋白的表達，結(jié)果如圖5所示，E-cadherin和Slug蛋白表達的陽性部位主要定位于細胞核，而Vimentin主要定位于細胞質(zhì)。在對照組移植瘤組織中Vimentin、Slug明顯可見有棕褐色著色，但si-Tiam1組移植瘤組織中棕褐色表達減弱，而E-cadherin蛋白在兩組中的表達相反，表明沉默Tiam1能下調(diào)Vimentin、Slug蛋白的表達，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達，提示沉默Tiam1能夠抑制裸鼠移植瘤組織的EMT進程。

圖5 IHC染色檢測沉默Tiam1對胰腺癌裸鼠移植瘤組織EMT相關蛋白的影響(×200)

3 討 論

Tiam1是鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF)家族成員之一，主要通過催化GTP/GDP轉(zhuǎn)換并激活Rho家族重要成員Rac1的活性，從而影響腫瘤細胞的遷移、侵襲等活動〔7〕。呂錚等研究表明，Tiam1高表達與結(jié)直腸腺患者的預后密切相關〔8〕。楊洋等〔9〕研究顯示，Tiam1蛋白在卵巢癌組織中高表達，且與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關。Shi等〔10〕研究也證實，在胃癌細胞中，沉默Tiam1能夠通過調(diào)節(jié)細胞骨架重建抑制細胞的遷移與侵襲。本課題組前期研究〔6〕利用體外細胞實驗證實沉默Tiam1可顯著抑制胰腺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲。因此，本論文將siRNA轉(zhuǎn)染后的BxPC-3細胞接種于裸鼠皮下構建胰腺癌移植瘤模型，結(jié)果顯示，沉默Tiam1能顯著抑制移植瘤的瘤體體積和質(zhì)量。Ki-67作為核抗原與腫瘤細胞生長、增殖密切相關，已被廣泛應用于腫瘤細胞的增殖活性鑒定。本研究結(jié)果表明，沉默Tiam1可明顯抑制移植瘤組織中Ki-67的蛋白表達。

EMT進程使腫瘤細胞表型發(fā)生改變，從而獲得高侵襲能力，這在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著至關重要的作用〔11〕。EMT進程通常伴隨細胞上皮標志物E-cadherin的減少，細胞間質(zhì)標志物如Vimentin、N-cadherin及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug等的增加〔12〕。目前，已有研究報道Tiam1在肺腺癌細胞中陽性表達，其影響腫瘤發(fā)展的機制可能與E-cadherin表達的下降及Vimentin的表達增強有關〔13〕。Liu等〔14〕研究表明，Tiam1的異常表達能夠通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控EMT進程，進而促進甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移。本課題前期研究結(jié)果證實，沉默Tiam1能夠調(diào)控胰腺癌細胞的EMT進程。因此，本論文進一步通過免疫組織化學染色檢測沉默Tiam1對裸鼠移植瘤組織EMT相關蛋白表達的影響。結(jié)果提示沉默Tiam1抑制胰腺癌移植瘤組織的EMT進程。

綜上，沉默Tiam1對胰腺癌裸鼠移植瘤的生長具有抑制作用，其影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制可能與Ki-67、Vimentin、Slug表達的降低及E-cadherin表達的升高有關。本研究提示Tiam1在小鼠胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，為胰腺癌的分子靶向治療提供新的理論依據(jù)。