瑞芬太尼預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷老年大鼠血小板衍生因子、髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響

劉姝 周金鳳 曾憲晶 祝美珍 俞睿

(井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院 1麻醉科，江西 吉安 343000；2中醫(yī)科；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

腦血管疾病目前已經(jīng)成為中國中老年人群致死、致殘的主要疾病之一，其中缺血性腦卒中最為突出，約占腦血管疾病的70%〔1〕。而腦缺血再灌注(I/R)損傷則是缺血發(fā)生一定時間后再次恢復(fù)血流灌注，但在多數(shù)情況下，缺血后再灌注不僅沒有使腦組織功能恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重缺血導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙〔2〕，是引起腦血管病惡化的重要機(jī)制之一，有效干預(yù)I/R損傷是防治腦損傷進(jìn)一步加劇的重要環(huán)節(jié)。研究證實〔3～5〕，使用瑞芬太尼預(yù)處理的動物可有效減輕心、肝、腎等器官再灌注損傷程度，其中關(guān)于腦I/R保護(hù)的相關(guān)機(jī)制鮮有報道，有研究表明〔6，7〕瑞芬太尼預(yù)處理與腦保護(hù)之間存在相互關(guān)系，但未進(jìn)一步述及具體機(jī)制。本實驗觀察瑞芬太尼預(yù)處理對I/R損傷大鼠腦組織血小板衍生因子(PDGF)、髓鞘堿性蛋白(MBP)表達(dá)的影響并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試驗動物與造模方法 健康SPF級SD大鼠50只，15～24月齡，隨機(jī)分為空白組5只，假手術(shù)組、腦I/R組、瑞芬太尼預(yù)處理組各15只，體重(350±50)g，從廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購入(生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2003-0003，使用許可證號：SYSK桂2003-0005)，在本校動物實驗房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，參照longa法〔8〕制備大鼠中腦動脈閉塞(MCAO)模型，術(shù)后2 h拔出栓線約10 mm，恢復(fù)血流，制成大鼠急性腦I/R損傷模型。造模成功后以上各組按術(shù)后2 h I/R不同處死時間點(diǎn)6 h、12 h、24 h分為3個亞組，每組5只。假手術(shù)組：僅行左側(cè)頸總動脈分離，未行插線不結(jié)扎也不做缺氧缺血處理。瑞芬太尼預(yù)處理組：在行MCAO手術(shù)前2 h經(jīng)股靜脈注入瑞芬太尼(人福醫(yī)藥公司，批號：6180309)，給藥劑量參照文獻(xiàn)〔9〕中大鼠換算的標(biāo)準(zhǔn)方程計算，每次輸注5 min，連續(xù)3次，輸注速率為1.0 μg/(kg·min)，每次輸注完后給予5 min間歇期，整個預(yù)處理過程約30 min。I/R組：操作步驟同瑞芬太尼預(yù)處理組，輸注等量生理鹽水代替瑞芬太尼。大腦MCAO模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)：①患側(cè)右前爪部分屈曲或完全屈曲；②行走時身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；③行走時身體向偏癱側(cè)跌倒。

1.2采樣制作 大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪開胸腹腔，暴露心臟，通過心臟快速灌注約100 ml生理鹽水，灌洗至肺臟變白，右心耳流出清亮液體后，再灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)約150 ml固定，至大鼠尾巴及四膚強(qiáng)直僵硬后，撬開顱骨，完整取腦放入生理鹽水中漂洗殘血后，置于4% PBS中固定。24 h后腦組織取出切塊，經(jīng)不同梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，用切片機(jī)制作約4 μm厚度的冠狀切片，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)病理變化。

1.3指標(biāo)檢測 免疫組化操作步驟：取出上述包埋切片脫蠟，檸檬酸熱修復(fù)10 min，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min；封閉血清37℃中水浴30 min，滴加山羊血清50 μl/片，37℃封閉內(nèi)源性生物素20 min；滴加一抗1∶100，50 μl/片，40℃20 h；滴加生物素標(biāo)記的二抗50 μl/片，室溫30 min；滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素50 μl/片，37℃ 30 min；上述每步驟間均用PBS漂洗5 min×3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。在10×40倍光鏡下觀察胞質(zhì)有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取觀察5個視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0軟件，成組設(shè)計多樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA檢驗)，多樣本均數(shù)組間比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 空白組、假手術(shù)組：大鼠神經(jīng)元形狀完整，多層密集排列，胞膜呈圓或橢圓形，核仁明顯，核染色質(zhì)清晰均勻。I/R組：鏡下神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，再灌注6 h時胞體腫脹，排列不齊，局部缺血周圍區(qū)水腫明顯，細(xì)胞腫脹，疏松淡染；再灌注24 h時神經(jīng)元壞死和凋亡明顯，水腫、腫脹減輕，胞體縮小，見大量固縮變性壞死神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核消失，部分區(qū)域核固縮深染，邊緣區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)內(nèi)形成微空泡，膠質(zhì)細(xì)胞增生。瑞芬太尼預(yù)處理組再灌注6 h時細(xì)胞多層密集，胞膜較完整，水腫不明顯，再灌注24 h時神經(jīng)元部分胞體縮小，色深染，周圍見少量固縮壞死神經(jīng)元，炎性細(xì)胞浸潤及少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，較I/R組病理改變減輕。見圖1。

2.2神經(jīng)功能缺損評分 MCAO術(shù)后，空白組與假手術(shù)組神經(jīng)功能評分均無明顯改變(P>0.05)。I/R組和瑞芬太尼預(yù)處理組在術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，與I/R組相比，瑞芬太尼預(yù)處理組神經(jīng)功能缺損評分減輕(P<0.05)，見表1。

表1 各組腦I/R各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分(分，

與空白及假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.05

2.3PDGF、MBP陽性細(xì)胞表達(dá) MCAO術(shù)后，與空白組、假手術(shù)組、I/R組比較，瑞芬太尼預(yù)處理組PDGF陽性細(xì)胞表達(dá)在各時間點(diǎn)均明顯升高(P<0.01)，I/R組PDGF陽性細(xì)胞表達(dá)與空白組、假手術(shù)組相比無顯著差異性(P>0.05)。I/R組MBP陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)其他與各組比較明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組I/R各時間點(diǎn)PDGF、MBP陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)(個/視野，

與瑞芬太尼預(yù)處理組比較：1)P<0.01;與I/R組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3 討 論

瑞芬太尼作為一種新型的超短效型阿片受體激動劑，是麻醉和鎮(zhèn)痛中常用藥物，已在臨床廣泛應(yīng)用，作為神經(jīng)傳遞素的抑制劑，易透過血腦屏障，快速達(dá)到血-腦平衡，藥物吸收后廣泛分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為腦損傷治療提供藥動學(xué)基礎(chǔ)。腦缺血發(fā)生后，隨著氧自由基大量釋放、鈣超載及谷氨酸受體激活等各種因素相互作用下，激活細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔10〕。在腦損傷過程中，MBP作為抗原激活免疫系統(tǒng)，缺血性腦損傷引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘斷裂崩解，MBP釋放可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔11〕，啟動炎癥損傷級聯(lián)反應(yīng)程序，隨著血流再灌注，神經(jīng)細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，加速細(xì)胞凋亡。研究表明MBP對神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用主要是由其強(qiáng)堿性決定的，這種強(qiáng)堿性使得MBP可以廣泛結(jié)合于神經(jīng)元膜表面，從而直接損傷神經(jīng)元質(zhì)膜，造成離子紊亂及細(xì)胞內(nèi)容物外漏，離子穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡〔11〕。研究〔12〕證實其過量表達(dá)與神經(jīng)損傷呈正相關(guān)。MBP 表達(dá)水平反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)有無實質(zhì)性損害，特別是有無髓鞘脫失的一個較為特異性的生化指標(biāo)，其含量水平反映了損害范圍的嚴(yán)重程度〔13〕。本實驗瑞芬太尼預(yù)處理組MBP表達(dá)水平明顯低，其機(jī)制可能是通過減輕MBP表達(dá)水平來達(dá)到腦保護(hù)，與臨床報道一致〔14〕。

PDGF是一種具有分裂能力和對細(xì)胞有增殖作用的因子，主要對特定細(xì)胞群起刺激作用，并且可以促進(jìn)有絲分裂，在控制細(xì)胞遷移分化方面有顯著意義。研究結(jié)果表明：PDGF-二聚體結(jié)構(gòu)(BB)是針對PDGF受體-β的最高親和配體，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和纖維細(xì)胞增長和繁殖〔15〕?？杉铀偌?xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原蛋白的形成，促進(jìn)損傷區(qū)修復(fù)。PDGF還是神經(jīng)元及其角質(zhì)細(xì)胞的重要生長因子，可以發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)血管張力、促進(jìn)血管生長等作用，在急性腦梗死患者康復(fù)治療中具有重要意義〔16〕。本實驗中瑞芬太尼預(yù)處理組腦組織PDGF含量增高，其原因可能與刺激腦組織細(xì)胞產(chǎn)生PDGF表達(dá)增加有關(guān)，有研究表明其通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的激活發(fā)揮作用〔17〕。

綜上，瑞芬太尼在I/R早期可能通過干預(yù)炎癥損傷級聯(lián)反應(yīng)程序，刺激神經(jīng)細(xì)胞的遷移增殖分化，發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)微血管生成作用。瑞芬太尼預(yù)處理可以減輕大鼠腦I/R損傷程度，減輕神經(jīng)元壞死和凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。