星形細(xì)胞上調(diào)基因-1及基質(zhì)金屬蛋白酶9在腎癌中表達(dá)及臨床意義

李淑靜 顧國(guó)建 盛維新 卑占宇

(1承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，河北 承德 067000；蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院 2病理科；3泌尿外科)

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,病理上70%～80%為腎透明細(xì)胞癌〔1〕。其對(duì)放化、療不敏感，手術(shù)是首選治療方案〔2〕。但因?yàn)槠淦鸩‰[匿,癥狀不明顯,診斷時(shí)多達(dá)三分之一的腎透明細(xì)胞癌患者已經(jīng)侵襲其他鄰近組織或轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處,約一半的病人會(huì)術(shù)后復(fù)發(fā),預(yù)后較差,嚴(yán)重威脅患者生命健康〔3〕。目前研究發(fā)現(xiàn)多種基因表達(dá)異常與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中星形細(xì)胞上調(diào)基因(AEG)-1及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9與其關(guān)系密切。本文采用Western印跡法及免疫組化方法檢測(cè)腎癌及癌旁組織中AEG-1及MMP9蛋白的表達(dá),并探討其臨床意義及相互聯(lián)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集蘇州大學(xué)附屬太倉(cāng)醫(yī)院泌尿外科2017年1～12月手術(shù)切除的腎癌及距癌灶3 cm以上的癌旁新鮮組織各15例。每例取一部分組織放置在液氮中，另一部分組織制成石蠟標(biāo)本保存。另從病理科收集2013年1月至2016年12月手術(shù)切除的66例腎癌石蠟標(biāo)本。所選患者手術(shù)前未接受放療、免疫或化療。共81例石蠟標(biāo)本，病理類型全部為腎透明細(xì)胞癌，其中男52例,女29例,年齡23～75歲,平均58.7歲。根據(jù)2010年美國(guó)聯(lián)合癌癥委員會(huì)(AJCC)腎癌臨床分期:Ⅰ期25例,Ⅱ期29例,Ⅲ期20例,Ⅳ期7例,病理上采用Fuhrman 分級(jí):其中G1期35例,G2期22例,G3期24例。門診或電話隨訪3～60個(gè)月。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1Western印跡檢測(cè)腎癌及癌旁組織中AEG-1及MMP9的表達(dá) 取出保存于液氮中的腎癌與癌旁組織標(biāo)本，切取 100 mg組織放入研缽，置于冰上，迅速研磨成粉；添加含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞(碧云天公司),離心，提取蛋白，沸水加熱3～5 min，使蛋白充分變性，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙酰胺凝膠電泳(PAGE),然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，3%牛血清白蛋白(BSA)阻斷后1 h,膜與一抗(AEG-1或MMP9 或β-actin 1∶1 000)4℃過夜,洗膜,添加二抗(1∶8 000),搖床搖動(dòng)1 h,隨后TBST洗膜,加發(fā)光液,曝光成像,β-actin 作為蛋白質(zhì)負(fù)荷計(jì)量。

1.2.2鏈霉卵白素-過氧化物酶(S-P)免疫組化染色法 實(shí)驗(yàn)中所用一抗兔抗人AEG-1單克隆抗體(1∶150)從 Zymed Laboratories公司購(gòu)買,兔抗人MMP9單克隆抗體(1∶100)、SP免疫組化試劑盒購(gòu)于福州邁新生物公司。將標(biāo)本連續(xù)4 μm切片，再脫蠟、水化后,每個(gè)標(biāo)本行蘇木素-伊紅(HE)和SP免疫組化染色,操作過程參見相關(guān)文獻(xiàn)〔4,5〕。AEG-1和MMP9以腫瘤細(xì)胞質(zhì)著色為陽(yáng)性細(xì)胞,由兩位病理科醫(yī)師結(jié)合染色細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度做出判斷。按陽(yáng)性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞的百分比評(píng)分:0分(無染色細(xì)胞),1分(<10%),2分(10%～50%),3分(>50%),再按顯色程度計(jì)分:0分(無染色細(xì)胞),1分(細(xì)胞被染淺黃色),2分(棕黃色),3分(棕褐色)，兩者相加≥3分為陽(yáng)性,0～2分為陰性〔5〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。

2 結(jié) 果

2.1AEG-1和MMP9在腎癌及癌旁腎組織中的表達(dá) Western印跡檢測(cè)結(jié)果提示，AEG-1 在15 例腎癌組織、癌旁腎組織中的相對(duì)值分別為(0.606±0.079)、(0.112±0.041)，腎癌組織中AEG-1蛋白 表達(dá)明顯高于癌旁腎組織(P<0.001)；MMP9 在腎癌組織中的表達(dá)(0.622±0.085)也顯著高于癌旁腎組織(0.179±0.078，P<0.001)，見圖1。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，AEG-1和MMP9陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì),陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，其中，癌組織AEG-1陽(yáng)性49例(60.5%)、陰性32例(39.5%)，MMP9陽(yáng)性51例(63.0%)，陽(yáng)性30例(37.0%)；癌旁組織AEG-1陽(yáng)性2例(13.3%)，陰性13例(86.7%)，MMP9陽(yáng)性3例(20.0%)，陽(yáng)性12例(80.0%)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖1 AEG-1和MMP9在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 AEG-1和MMP9在腎癌組織中的染色結(jié)果(DAB,×200)

2.2AEG-1及MMP9與腎癌病理、臨床特征的關(guān)系 AEG-1及MMP9蛋白表達(dá)增高與腎癌的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)(P<0.05);而與患者性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 AEG-1及MMP9表達(dá)的影響因素〔n(%)〕

2.3腎癌組織中AEG-1與MMP9的相關(guān)性分析 腎癌組織中，AEG-1與MMP9同陽(yáng)性41例，同陰性22例，AEG-1陽(yáng)性、MMP9陰性8例，AEG-1陰性、MMP9陽(yáng)性10例，AEG-1與MMP9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.531,P<0.001)。

2.4AEG-1和MMP9 與腎癌生存的相關(guān)分析 在腎癌組織中，AEG-1蛋白高表達(dá)的患者與低表達(dá)的患者相比，總生存較差(P=0.005),MMP9蛋白高表達(dá)的患者與低表達(dá)的患者相比，總生存較差(P=0.018),見圖3。

圖3 基于AEG-1和MMP9表達(dá)的腎癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

2002年,Su等〔6〕發(fā)現(xiàn)在人胚胎初級(jí)星形細(xì)胞被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后,有15個(gè)基因表達(dá)增高,稱為星形細(xì)胞上調(diào)基因(AEGs),其家族成員的中的AEG-1位于人染色體8q22。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),AEG-1在膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤組織高表達(dá),它可以抑制細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等〔5,7～9〕。

本研究中,Western印跡及免疫組織化學(xué)結(jié)果提示：AEG-1蛋白在腎癌細(xì)胞中的陽(yáng)性率明顯高于癌旁腎組織。其中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,AEG-1表達(dá)相對(duì)增高,AEG-1蛋白其表達(dá)水平隨病理分級(jí)增加而增加,并隨著臨床分期增加而增加,提示AEG-1與腎癌發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用,可用于腎癌的輔助診斷。本文隨訪結(jié)果提示,與AEG-1蛋白陰性患者相比，陽(yáng)性患者生存時(shí)間短,預(yù)后不良。這與其他組織腫瘤的預(yù)后相似〔10〕。綜上，AEG-1蛋白是很好的判斷患者預(yù)后的指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,Chang等〔9〕和Zhang等〔11〕等學(xué)者將腫瘤細(xì)胞中AEG-1進(jìn)行基因沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲能力明顯下降,這些研究表明AEG-1是潛在的腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。

MMP家族可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移〔12,13〕。MMP9在多種腫瘤組織中高表達(dá),而且與MMP9陰性患者相比，MMP9陽(yáng)性患者預(yù)后不良〔14〕。Western印跡及免疫組織化學(xué)結(jié)果提示： MMP9蛋白在腎癌細(xì)胞中的陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,MMP9表達(dá)相對(duì)增高,其表達(dá)水平隨病理分級(jí)增加而增加,并隨著臨床分期增加而增加,提示MMP9在腎癌發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用。Log-Rank檢驗(yàn)顯示與陰性患者相比，陽(yáng)性患者預(yù)后不良,這與在其他腫瘤組織中的研究相符合〔15〕,提示其可考慮用于腎癌的輔助診斷,及判斷患者預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn),腎癌組織中AEG-1蛋白升高,而MMP9表達(dá)也相應(yīng)升高,二者正相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),AEG-1可通過MMP9途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移〔15〕。本研究顯示,AEG-1基因可能通過MMP9途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,在腎癌發(fā)生發(fā)展中,AEG-1及MMP9可能起一定作用,聯(lián)合檢測(cè)AEG-1及MMP9有助于腎癌的輔助診斷和判斷患者的預(yù)后,對(duì)其進(jìn)一步研究,有望成為腎癌基因治療的新靶點(diǎn)。