結(jié)直腸癌Visfatin、MMP-14的表達(dá)及意義

榮瑋 徐晨 李雪松 劉婷 于秀文

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

隨著人們生活水平的提高及相應(yīng)生活方式的改變，結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率逐步增加。而在CRC的發(fā)病危險(xiǎn)因素中，肥胖具有明顯的獨(dú)立性〔1〕。內(nèi)脂素(visfatin)是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子具有類(lèi)胰島素作用、促炎、促進(jìn)脂肪組織分化和合成等多種生物學(xué)活性，血漿水平升高是中國(guó)患者早期和晚期CRC的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-14是MMPs家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜型MMP，是影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及腫瘤進(jìn)展的重要蛋白酶〔3〕。visfatin、MMP-14通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑，參與肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管生成等病理生理過(guò)程〔4～6〕，二者在CRC組織中是否存在相互關(guān)聯(lián)尚待證實(shí)。本研究應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測(cè) visfatin、MMP-14在CRC組織中不同水平的表達(dá)，將二者與CRC臨床病理因素的關(guān)系和相關(guān)性進(jìn)行分析，從而探討其在CRC侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，為CRC的診斷和靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2015～2017年齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院根治性切除術(shù)的CRC原發(fā)病例64例患者的新鮮手術(shù)切除標(biāo)本為觀(guān)察組，術(shù)前均未經(jīng)任何系統(tǒng)的放療和化療。對(duì)照組為對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)切端正常組織64例〔距癌邊緣>5 cm，后經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)證實(shí)無(wú)癌組織浸潤(rùn)〕。在不影響正常臨床病理檢驗(yàn)的前提下立即在無(wú)菌操作下一次取材適量的新鮮疑似癌組織標(biāo)本，并標(biāo)記好患者信息，在肉眼觀(guān)典型病變位置取10 mg放入RNase Free EP管內(nèi)，30 min內(nèi)放入-80℃超低溫冰箱冷凍儲(chǔ)存，剩余部分10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色證實(shí)均為CRC，與臨床病理診斷相符。男44例，女20例；發(fā)病年齡60歲以下的27例，60歲以上含60歲37例；發(fā)生部位結(jié)腸24例，直腸40例；腫瘤最大直徑<5 cm 31例，≥5 cm 33例；根據(jù)結(jié)直腸腸腺癌的組織學(xué)形態(tài)及分化程度可分為：高中分化36例，低分化28例；浸潤(rùn)<肌層27例，浸潤(rùn)≥肌層37例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例; TNM分期中Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。

1.2主要試劑 TAKARA公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) RT-PCR試劑盒分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和目的片段的擴(kuò)增。visfatin正義鏈5′-TGCCTTCGGTTCTGGTGGAGGTT-3′;visfatin反義鏈5′-ACAAAATTCCCTGCTGGCGTCCT-3′ ;MMP-14正義鏈5′-GGAACCGTGTAGCTTTGTGTCTGTC-3′；MMP-14反義鏈5′-TGAGGGTCCTGCCTTCAAGTG-3′；GAPDH正義鏈5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；GAPDH反義鏈5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′；鼠抗人visfatin 、MMP-14多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，工作液濃度為1∶600，免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RT-qPCR檢測(cè) 取-80℃保存的新鮮組織標(biāo)本按Trizol試劑盒說(shuō)明抽提組織總RNA，紫外分光光度法評(píng)估RNA的純度，A260/A280 的比值在1.8～2.1，總RNA樣品置-80℃保存?zhèn)溆谩０凑誧DNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄來(lái)獲得所需cDNA置-80℃保存待檢。按 RT-qPCR試劑盒的操作步驟，進(jìn)行 PCR 的擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)液在冰上進(jìn)行配制，反應(yīng)的體系20 μl，測(cè)定visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表達(dá)，GAPDH 作為內(nèi)參，根據(jù)各目的基因的 CT 值，用 2-ΔΔCt法比較CT值。

1.3.2免疫組織化學(xué)法 切片常規(guī)脫蠟，水化后，3%過(guò)氧化氫(H2O2)-甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，枸櫞酸高壓修復(fù)10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3×3 min，一抗4℃冰箱過(guò)夜，第2天切片恢復(fù)室溫后，依次滴加試劑A：反應(yīng)增強(qiáng)液，試劑B：酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫各孵育15 min，中間PBS洗3×3 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用半定量積分法判定結(jié)果，顯色度按細(xì)胞著色深淺計(jì)分：0分基本無(wú)著色;1分淺黃;2分淺棕，3分深棕。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分;陽(yáng)性細(xì)胞<10%為1分;陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%為2分;陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%為3分;陽(yáng)性細(xì)胞>75%以上為4分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS25.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表達(dá)情況 visfatin mRNA在觀(guān)察組和對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)水平分別為4.315 3±2.478 51和1.010 0±0.891 55，兩組間差異有顯著性意義(P<0.01)。MMP-14 mRNA在觀(guān)察組和對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)水平分別為3.937 2±2.482 67和0.911 2±0.938 74，兩組間差異有顯著性意義(P<0.01)。

2.2visfatin mRNA和MMP-14 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析 visfatin mRNA和MMP-14 mRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.758，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.3visfatin和MMP-14 免疫組化的表達(dá)情況 visfatin免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。visfatin在對(duì)照組、觀(guān)察組的陽(yáng)性率分別為29.7%(19/64)、67.2%(43/64)，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MMP-14免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在正常腸黏膜不表達(dá)或表達(dá)較弱，在癌組織和間質(zhì)中彌漫分布強(qiáng)表達(dá)或僅在間質(zhì)強(qiáng)表達(dá)，見(jiàn)圖2。MMP-14在對(duì)照組和觀(guān)察組的陽(yáng)性率分別為17.2%(11/64)、62.5%(40/64)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 免疫組化檢測(cè)兩組visfatin、MMP-14表達(dá)(×200)

2.4visfatin與MMP-14表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理因素的關(guān)系 visfatin和MMP-14的表達(dá)與患者年齡、性別和腫瘤部位、大小無(wú)相關(guān)性，與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌患者visfatin與MMP-14表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(n)

2.5visfatin與MMP-14在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 visfatin和MMP-14在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 visfatin與MMP-14在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不再只是一種沉默的能量?jī)?chǔ)存器官，僅用來(lái)評(píng)估人體營(yíng)養(yǎng)狀況，也是一種很重要的內(nèi)分泌器官，分泌多種具有活躍生物學(xué)活性的物質(zhì)，如visfatin、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等，這些物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)作脂肪細(xì)胞因子。visfatin與煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)、前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子(PBEF)具有相同結(jié)構(gòu)的同一蛋白質(zhì)分子。人類(lèi)該相關(guān)基因位于第7號(hào)染色體，長(zhǎng)約37.41 kb，含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，可編碼473個(gè)氨基酸，是一類(lèi)具有類(lèi)胰島素作用、促炎、促進(jìn)脂肪組織分化和合成等多種生物學(xué)活性的脂肪細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于體內(nèi)多種組織器官。visfatin在胃癌的研究〔7〕顯示，抵抗素和visfatin協(xié)同促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。乳腺癌組織visfatin、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、年齡和腫瘤大小，被確定為高度相互作用并與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)。子宮內(nèi)膜癌高visfatin血清水平預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后差。visfatin水平上升與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與疾病惡化程度和腫瘤分期也有關(guān)〔8～10〕。

MMP-14基因組定位于14q11，全長(zhǎng)大于10 kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，編碼582個(gè)氨基酸。MMP-14可以通過(guò)激活MMP-2、MMP-9、MMP-13等，降解腫瘤細(xì)胞周?chē)拈g質(zhì)成分，還可以直接降解腫瘤間質(zhì)中的如玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白-1、和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原等成分，涉及到多種生物的細(xì)胞外基質(zhì)的降解過(guò)程和加速血管生成，被認(rèn)為是影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及腫瘤進(jìn)展的重要蛋白酶。MMP-14在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)的量和強(qiáng)度均上調(diào)，并和惡性腫瘤的臨床 TNM 分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔11，12〕。

本研究通過(guò)基因水平和蛋白水平證實(shí)visfatin和MMP-14在CRC中高表達(dá)，且與CRC的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。說(shuō)明二者在CRC的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Adya等〔13〕發(fā)現(xiàn)visfatin能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)、MMP-2，MMP-9增多，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂和新生血管的形成。MMP-14在對(duì)MMP-2進(jìn)行有效活化的同時(shí)又反作用于 MMP-14，使 MMP-14表達(dá)明顯增高，形成環(huán)式循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤離開(kāi)原發(fā)部位發(fā)生轉(zhuǎn)移〔14，15〕，此種作用使腫瘤轉(zhuǎn)移潛能大大增加。PI3K/Akt通路具有激活MMP-14和MMP-2促進(jìn)腫瘤血管生成擬態(tài)，visfatin通過(guò)AKT/PI3K和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖，并對(duì)細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用〔4〕。骨關(guān)節(jié)炎患者其visfatin濃度較高，且與Ⅱ型膠原蛋白的降解產(chǎn)物呈正相關(guān)，表明visfatin參與軟骨基質(zhì)的降解，其中重要一點(diǎn)是visfatin促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)MMP-14降解軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原所需酶類(lèi)〔16〕。綜上所述，visfatin與MMP-14功能上相互影響，但目前還沒(méi)有在CRC組織中關(guān)于二者相關(guān)性的報(bào)道。本研究在基因水平和蛋白水平還研究了二者的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者在結(jié)直腸癌存在明顯的相關(guān)性，visfatin的上調(diào)影響MMP-14的表達(dá)。上述關(guān)于二者相互作用的機(jī)制是否存在于CRC中尚待研究。二者參與機(jī)體多種生理和病理進(jìn)程，在腫瘤、心血管疾病、炎癥相關(guān)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病中的作用已受到重視。進(jìn)一步深入了解二者的相互關(guān)系及相互作用機(jī)制將有助于疾病的診斷和靶向藥物的研究，具有一定的醫(yī)學(xué)價(jià)值。