基于金-汞納米顆?？梢暬瘷z測海產(chǎn)品中的甲基汞

陳清愛， 雷麗琴， 傅依靈， 楊瑋娟

(1. 福建商學院旅游與休閑管理學院， 福建 福州 350012； 2. 福建農(nóng)林大學植物保護學院， 福建 福州 350002)

0 引言

汞污染造成的環(huán)境問題和食品安全問題[1]正逐步引起人們的高度重視. 自然界中的汞根據(jù)形態(tài)不同可分為無機汞和有機汞， 其中有機汞包含甲基汞和乙基汞. 甲基汞的毒性不但高于無機汞， 并且甲基汞脂溶性更強， 更容易經(jīng)由人體胃腸道吸收， 穿過血腦屏障從而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng). 據(jù)研究報道海產(chǎn)品中汞的主要形態(tài)是甲基汞， 例如魚肉中95%以上汞形態(tài)為甲基汞， 它容易通過食物鏈富集并造成毒性傷害， 通常食物鏈等級越高， 富集的甲基汞含量越高[2]. 上世紀50年代發(fā)生在日本的水俁病， 正是由于食用了甲基汞污染的海產(chǎn)品造成的群體性中毒事件. 為了保障食品安全， 各國對海產(chǎn)品制定了最大殘留限量標準， 其中， 我國規(guī)定魚類中甲基汞的最大殘留限量標準為0.5 mg·kg-1， 食肉魚類中甲基汞最大殘留限量為1.0 mg·kg-1[3].

對于食品安全檢測來說， 僅檢測總汞含量無法準確評估其毒性， 因此需分別檢測不同形態(tài)汞的濃度，而有機汞的測定一直以來是食品安全與環(huán)境評價的重點和難點. 目前有機汞檢測方法主要依賴于離子色譜法、 液相色譜法和毛細管電泳法等分離方法與原子熒光光譜法、 電感耦合等離子體質(zhì)譜法等檢測方法的聯(lián)用技術(shù)[4-8]， 這些方法需要復(fù)雜的樣品制備或昂貴的大型儀器. 近年來， 為了避免繁瑣的樣品制備并實現(xiàn)現(xiàn)場便攜式檢測， 有機汞殘留的快速檢測方法也取得了一定的進展. 例如Zhang等[9]通過合成一種有機小分子熒光探針同時檢測無基汞和甲基汞， 但這一方法的廣泛使用受有機小分子合成和熒光檢測穩(wěn)定性的限制. 自從富含胸腺嘧啶的DNA被發(fā)現(xiàn)能夠與汞形成T-Hg-T結(jié)構(gòu)， 便被大量用于無機汞離子的測定[10]. 近年來， DNA 識別在甲基汞檢測中的應(yīng)用也受到越來越多的關(guān)注. 其中， Deng等[11]篩選并優(yōu)化了甲基汞特異性核酸序列， 并結(jié)合金屬納米合金法設(shè)計了甲基汞的熒光快速檢測方法. Chen等[14]進一步通過CE-ICP-MS方法驗證了這些DNA序列可用于甲基汞識別及分離檢測. 同時， 研究者們在此基礎(chǔ)上發(fā)展了多種可視化檢測方法， 例如設(shè)計了銀-汞納米合金生長法和基于金納米棒的顯色方法等， 用于甲基汞和乙基汞的快速、 可視化檢測， 然而上述可視化檢測方法需要在加熱反應(yīng)或經(jīng)過額外的修飾步驟才能完成檢測[13-14]. 因此， 開發(fā)一種更加溫和、 廉價、 快速的甲基汞檢測方法并進一步提高其檢測靈敏度， 具有重要的應(yīng)用價值和實際意義.

圖1 基于HT9核酸調(diào)控金-汞納米顆粒生長的甲基汞可視化檢測示意圖Fig.1 Colorimetric detection of CH3Hg+ with a label-free Au@Hg nanoparticle growth mediated by HT9 DNA template

本實驗設(shè)計一種基于核酸調(diào)控金-汞納米顆粒生長的非標記、 可視化甲基汞檢測方法， 其原理如圖1所示， 利用能特異性識別甲基汞的HT9 DNA序列為模板， 結(jié)合甲基汞后， 經(jīng)硼氫化鈉還原后形成不同濃度的汞納米晶種， 在此基礎(chǔ)上加入氯金酸和鹽酸羥胺， 使納米晶種繼續(xù)生長成金-汞納米顆粒， 呈現(xiàn)由無色向紫紅色的顏色變化. 研究探討傳感體系的可行性， 討論實驗條件對該方法測定結(jié)果的影響， 并將該方法用于海產(chǎn)品提取液中甲基汞的快速可視化檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

硝酸汞(99.9%， 質(zhì)量分數(shù))、 氯化甲基汞、 氯金酸、L-半胱氨酸購自西格瑪奧德里奇有限公司， 硼氫化鈉、 氯化鈉、 氯化鎂、 三氯化鐵、 氯化亞鐵、 氯化鉀、 氯化鈣、 硝酸銅、 硝酸鉛、 氯化鎘、 氯化鋅、 氯化鋁、 硝酸鎳、 氯化鑭、 氯化鈷、 硝酸鉻均購自國藥集團化學試劑有限公司， 上述化學試劑均為分析純； 實驗用水為二次蒸餾水. DNA序列由上海生工生物技術(shù)有限公司(上海， 中國)合成， 并由該公司通過HPLC 純化. 384孔透明酶標板購自美國康寧公司， 吸收光譜掃描使用Tecan SparkTM 10M多功能酶標儀(瑞士帝肯集團公司)， 電感耦合等離子體質(zhì)譜使用安捷倫7700型(美國安捷倫科技公司)， 離子色譜使用美國Thermo Fisher公司ICS-2100型， 透射電鏡表征使用日立高新透射電子顯微鏡HT7700 (120 kV)(日立高新技術(shù)公司)， 水合粒徑檢測使用Nanotrac Wave Zeta電位儀(美國麥奇克公司).

1.2 實驗方法1.2.1 基于金-汞納米顆粒生長檢測汞離子

在50 μL含不同濃度甲基汞的緩沖液Tris-HCl (10 mmol·L-1Tris-HCl, 100 mmol·L-1NaCl, 2 mmol·L-1MgCl2, pH=7.0)中加入10 μL 37.5 μmol·L-1DNA， 混勻后室溫靜置5 min， 加入5 μL 25 mmol·L-1NaBH4(現(xiàn)配現(xiàn)用， 冰水)， 混勻， 室溫靜置 20 min待充分反應(yīng)， 加入5 μL 200 mmol·L-1NH2OH·HCl溶液及50 μL 1.0 mmol·L-1HAuCl4溶液， 混勻， 直接取50 μL加入384孔酶標板測定400～1 000 nm 吸收光譜. 由于甲基汞溶液毒性很高， 必須在通風良好的環(huán)境中配制， 并應(yīng)格外小心， 避免皮膚直接接觸. 實驗中產(chǎn)生的所有含汞廢物的處置應(yīng)按照實驗室規(guī)范進行.

1.2.2選擇性實驗

選擇甲基汞濃度為5 μmol·L-1, 分別選取常見的干擾離子Al3+、 Ni2+、 Cr3+、 Ca2+、 K+、 Fe3+、 Fe2+、 La3+、 Co2+、 Cd2+、 Cu2+、 Pb2+各500 μmol·L-1， 無機汞濃度為5、 500 μmol·L-1, 配制于緩沖液中， 與10 μL 37.5 μmol·L-1DNA混勻后室溫靜置5 min， 加入5 μL 25 mmol·L-1NaBH4(現(xiàn)配現(xiàn)用， 冰水)混勻， 室溫靜置20 min待充分反應(yīng)； 加入5 μL 200 mmol·L-1NH2OH·HCl及50 μL 1.0 mmol·L-1HAuCl4， 混勻， 取50 μL加入384孔酶標板測定400～1 000 nm 吸收光譜.

1.2.3加標實際樣品中甲基汞的檢測

小黃魚、 海帶、 鮑魚樣品購自福州市場， 購買后儲存于冰上， 立即送到實驗室. 海帶樣品表面經(jīng)過純水沖洗后， 用無塵紙吸走表面水分. 鮑魚樣品取可食部分， 小黃魚切取食用肌肉部分， 將上述3種海產(chǎn)品分別打碎， 均質(zhì)， 保存于-20 ℃冰箱. 準確稱取5.0 g海帶、 鮑魚肉、 小黃魚肉均質(zhì)樣品， 加標樣品中加入500 ng·g-1甲基汞標準溶液， 放入100 mL聚四氟乙烯消解瓶中， 加入20 mL 1 mol·L-1鹽酸溶液， 蓋緊后放入微波消解器中. 微波系統(tǒng)功率為400 W， 70 ℃加熱5 min. 將提取物冷卻至室溫后， 移出上清液. 再加入20 mL 1mol·L-1鹽酸溶液, 以同樣方式重復(fù)提取殘留物1次， 合并兩次上清液. 從中取1 mL提取液， 用0.22 μm濾膜過濾后加入3 ku超濾管中， 10 000 r·min-1離心5 min以分離大分子基質(zhì)， 從收集管的濾液中取400 μL， 用真空離心濃縮儀濃縮至接近干燥， 加入50 μL反應(yīng)緩沖液Tris-HCl (10 mmol·L-1Tris-HCl, 100 mmol·L-1NaCl, 2 mmol·L-1MgCl2, pH=7.0)充分溶解， 用本研究所發(fā)展的方法檢測. 將空白樣品微波提取液與等體積2.0 mmol·L-1L-半胱氨酸(pH=2.0)混勻絡(luò)合， 加標樣品用1.0 mmol·L-1L-半胱氨酸 (pH=2.0) 稀釋62.5倍， 取25 μL通過 IC-ICP-MS 分析對比結(jié)果， IC-ICP-MS分離檢測條件參考文獻[5]， 分離柱為兩個串聯(lián)的Zorbax SCX陽離子柱， 流動相為1.0 mmol·L-1L-半胱氨酸(pH 2.0)， 流速為1 mL·min-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 基于納米晶種及納米金汞合金的表征

通過動態(tài)光散射法表征金-汞納米顆粒的生長情況， 空白樣品與DNA混合后加入硼氫化鈉還原， 通過Zeta電位儀未測得納米顆粒， 加入氯金酸生長后， 同樣未測得分散的納米顆粒. 含甲基汞離子的樣品經(jīng)硼氫化鈉還原后， 溶液呈無色， 水合粒徑為(4.7±1.3)nm， 如圖2(a)所示， 在pH=7.0緩沖液中ζ電位為-200 mV， 說明被還原的汞納米顆粒被帶負電的DNA包裹， 同時DNA作為穩(wěn)定劑使納米顆粒分散于含高濃度鹽緩沖液中. 通過透射電鏡表征， 經(jīng)還原獲得的汞納米晶種為分散的球狀顆粒， 如圖2(b)所示， 其粒徑分布為(2.5±1.1)nm， 如圖2(c)所示. 加入氯金酸并且進一步還原后， 溶液由無色變?yōu)樽霞t色， 此時經(jīng)動態(tài)光散射測得水合粒徑為(30.2±10.8)nm， 如圖2(d)所示， 在pH=7.0緩沖液中ζ電位為+0.1 mV， 說明帶負電的晶種顆粒幾乎完全被金還原覆蓋形成核-殼結(jié)構(gòu)的Au@Hg納米合金顆粒. 通過透射電鏡表征可知， 經(jīng)生長獲得的金-汞納米顆粒為分散的球狀顆粒， 如圖2(e)所示， 經(jīng)統(tǒng)計， 其粒徑分布為(25.4±8.0)nm， 如圖2(f)所示.

圖2 金-汞納米合金生長不同反應(yīng)階段的表征Fig.2 Characterization of Au@Hg nanoparticle at different growth stages

2.2 DNA 模板的優(yōu)化

在已有文獻報道的基礎(chǔ)上， 選擇識別汞離子的富T 堿基DNA序列作為研究對象， DNA 序列如表1所示， 這些序列被報道可用于識別甲基汞離子或無機汞離子[11, 15]. 本文研究不同形態(tài)汞存在下， DNA序列對于金-汞納米顆粒生長的影響， 并獲得最優(yōu)的DNA序列. 結(jié)果如圖3所示， HT9 DNA對于甲基汞離子的特異性最好且信號最強， 相應(yīng)的吸收光譜如圖4所示， 因此選擇HT9 DNA作為模板用于金-汞納米顆粒生長從而實現(xiàn)甲基汞的檢測.

表1 檢測所用DNA 序列

圖3 不同序列DNA調(diào)控生長金-汞納米顆粒照片F(xiàn)ig.3 Photographs of Au@Hg nanoparticle grown by different sequences of DNA

圖4 不同序列DNA調(diào)控金-汞納米顆粒生長響應(yīng)光譜圖Fig.4 Response spectrum of Au@Hg nanoparticle grown by different sequences of DNA

2.3 金-汞納米顆粒生長體系對于甲基汞的檢測性能

在最優(yōu)實驗條件下(HT9 DNA 濃度為37.5 μmol·L-1， NaBH4濃度為25 mmol·L-1， 還原時間為20 min， 鹽酸羥胺溶液濃度為200 mmol·L-1， 氯金酸溶液濃度為1.0 mmol·L-1)， 考察傳感體系可視化檢測甲基汞的效果， 如圖5所示. 從圖5(a)可觀察到傳感體系檢測方法甲基汞的吸光圖譜變化， 隨著甲基汞濃度的升高， 傳感體系在550 nm處的吸光峰也隨之上升. 由圖5(b)可知， 傳感體系在550 nm處的吸收值與甲基汞離子濃度存在一定的線性關(guān)系. 當甲基汞濃度在0.05～4.00 μmol·L-1范圍內(nèi)， 傳感體系在550 nm處的吸收值與甲基汞離子濃度具有良好的線性關(guān)系, 其線性方程為A550=0.041 1×c(CH3Hg+)+0.1769，r=0.990， 以3σ/k( 其中σ= 0.000 14，k= 0.041 1) 計算的儀器檢測限為0.01 μmol·L-1. 此外， 隨著甲基汞濃度的升高， 傳感體系的顏色由無色變?yōu)樽仙⒅鸩郊由?見圖5(c))， 通過目視法可檢測甲基汞濃度低至0.20 μmol·L-1.

圖5 傳感體系檢測甲基汞Fig.5 Detection of methyl mercury by the sensor system

2.4 特異性研究

通過含不同離子與空白樣品在550 nm處的吸光度比為信號/背景值， 評價不同金屬離子對汞離子檢測的干擾情況. 如圖6所示， 5、 500 μmol·L-1無機汞離子(Hg2+)及500 μmol·L-1其他金屬離子Al3+、 Ni2+、 Cr3+、 Ca2+、 K+、 Fe3+、 Fe2+、 La3+、 Co2+、 Cd2+、 Cu2+、 Pb2+, 對5 μmol·L-1甲基汞的檢測幾乎無干擾. 由于反應(yīng)緩沖液中含100 mmol·L-1Na+及5 mmol·L-1Mg2+， 因此無需額外評估這兩種常見金屬離子對于檢測的干擾.

圖6 甲基汞可視化傳感器選擇性考察Fig.6 Specificity of the proposed colorimetric assay

2.5 方法驗證和實際樣品的分析

使用本方法測定市售海帶、 鮑魚、 小黃魚等3種海產(chǎn)品加標樣品中甲基汞含量， 并將檢測結(jié)果與離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(IC-ICP-MS)檢測所得參考值進行比較. 海產(chǎn)品的前處理方法[9]和檢測方法[6]參考已報道文獻. 圖7為 Hg2+和 甲基汞的IC-ICP-MS 分離譜圖. 如圖7所示， 經(jīng)半胱氨酸絡(luò)合后， 含有1 μg·g-1甲基汞經(jīng)IC-ICP-MS檢測, 保留時間為50 s， 而含有1 μg·g-1Hg2+的保留時間為95 s. 以小黃魚提取液和加入0.5 μg·g-1甲基汞的加標樣品為例， 圖8為實際樣品中的甲基汞 IC-ICP-MS 譜圖. 從圖8中的小分離峰可以看出小黃魚提取液中汞的保留時間為50 s， 說明其形態(tài)主要為甲基汞， 這與文獻所報道的魚肉中95%以上的汞形態(tài)為甲基汞相吻合； 同時也能檢測到加標樣品的甲基汞濃度. 本方法所得結(jié)果與IC-ICP-MS檢測結(jié)果對比(見表2)基本吻合， 5次重復(fù)測定結(jié)果的相對標準偏差小于 4.6%， 對于0.5 μg·g-1甲基汞加標回收率為90.4%～97.0%. 上述結(jié)果表明， 本方法用于海產(chǎn)品提取液分析具有較好的可靠性和準確度.

圖7 Hg2+和 甲基汞的IC-ICP-MS 分離譜圖Fig.7 IC-ICP-MS chromatogram for separation of Hg2+ and methyl mercury

圖8 實際樣品中甲基汞的 IC-ICP-MS 譜圖 Fig.8 IC-ICP-MS chromatogram for methyl mercury in real samples

表2 不同海產(chǎn)品空白實際樣品與加標樣品檢測結(jié)果(n=5)

3 結(jié)語

本研究發(fā)展了一種甲基汞離子的快速可視化檢測方法， 該方法基于HT9核酸序列對于甲基汞離子的特異性識別， 通過晶種生長法還原后形成金-汞納米顆粒， 并結(jié)合金-汞納米顆粒的表面等離子體效應(yīng)， 隨著甲基汞濃度的升高， 呈現(xiàn)紫紅色的顏色變化， 從而實現(xiàn)甲基汞的檢測. 與以往報道的基于金納米聚集顯色方法相比[16]， 本方法通過HT9 DNA 特異性識別甲基汞離子， HT9 DNA作為汞納米晶種的模板和保護劑， 使納米晶種穩(wěn)定分散于高鹽濃度的溶液中， 經(jīng)測定， 所生成的納米晶種在Tris-HCl中ζ電位為-200 mV， 分散性好， 從而可作為第二步生長的模板， 獲得穩(wěn)定的金-汞納米顆粒. 含有甲基汞的濃度越高， 形成的金-汞納米顆粒濃度越高， 樣品在550 nm處的吸光度值越高， 顏色變化隨著甲基汞濃度升高由無色過渡為紅色， 避免了由于高鹽濃度樣品造成納米顆粒聚沉而產(chǎn)生假陽性結(jié)果， 因此抗基質(zhì)干擾能力較強， 同時本方法背景信號低、 操作簡單有效， 30 min內(nèi)即可完成， 非標記的檢測法使得成本更加低廉. 本方法成功應(yīng)用于海帶、 鮑魚、 小黃魚加標樣品提取液的檢測， 回收率在90.4%～97.0%之間， 與IC-ICP-MS檢測結(jié)果相近， 具有較好的準確度和選擇性.