石斛多糖抑制自發(fā)性高血壓大鼠晚期糖基化終產(chǎn)物受體mRNA的有效劑量觀察*

賴騰芳, 李近都, 鄒才華, 曾德創(chuàng), 梁燁, 陸克興, 潘興壽, 李天資△

右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1心血管內(nèi)科，3腺體外科，4心胸外科, 5臨床教學部(廣西百色 533000)； 2廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科(廣西南寧 530021)

葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類的基團與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等分子末端的胺基發(fā)生縮合反應生成穩(wěn)定的共價加成物早期糖基化產(chǎn)物，后者再經(jīng)脫水、氧化及化學重排等反應變成晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-product，AGE)，機體內(nèi)過多的AGEs在沉積，通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-product，RAGE)和非受體途徑參與動脈粥樣硬化(AS)等的慢性血管退化性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，備受關(guān)注[1]。石斛(dendrobium)有抑制炎癥反應，增強免疫力等功效，在抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應中揮了積極的作用，但其作用的靶點及其機制還不完全清楚[2]。循證醫(yī)學(EBM)是運用實驗觀察信息，選取準確的有效劑量給患者治療[3]。為了解石斛多糖藥物對AGE和RAGE mRNA水平影響的最低有效劑量。本研究于2017年1月至2018年5月觀察不同劑量石斛多糖治療自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，于治療前后觀察其AGE和腹肌RAGE mRNA表達水平，并與對照組比較。

1 材料與方法

1.1 石斛多糖 采用廣西根遼生物技術(shù)有限公司的移栽鐵皮石斛組培苗種植，采集：月齡為 (26±0.5)月的鮮品石斛全株，經(jīng)本院陸高翔副主任藥師鑒定為鐵皮石斛(dendrobium officinale)。稱取鐵皮石斛莖(100.0±1.0) g，加入(300±1.0) mL水，浸泡(6±0.1) h，再加入(200±1.0)mL水，采用熱水回流加纖維素酶(Cellulase)浸提法提取，將濾液水浴加熱濃縮至含生藥量為1 g/mL的石斛多糖藥飲(以下簡稱石斛)藥液，殺菌，貯存于4 ℃冰箱內(nèi)備用，使用時用常溫白開水稀釋至所需濃度。

1.2 動物與飼料 (1)SHR均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(粵)2013-0034。(2)鼠飼料丸由上海新奇特種飼料廠提供。選取雄性SHR 36只，均為2月齡，體重(213±5)g，普通級。(3)喂養(yǎng)方法：架式籠養(yǎng)，每組1籠，室溫(20±2)℃，相對濕度(75±5)%，光照明暗各12h交替。6組均等量喂鼠飼料丸，飲用水自由飲用。連續(xù)2個月。

1.3 動物分組和給藥方法 (1)隨機分為6組，每組6只，分別為對照組和5組石斛治療組。(2)給藥方法：對照組每只SHR口腔給予常溫白開水1.0 mL/d，治療1組每只鼠口腔給予石斛0.10 g/d(0.10 g組)；治療2組每只鼠口腔給予石斛0.12 g/d(0.12 g組)；治療3組每只鼠口腔給予石斛0.14 g/d(0.14 g組)；治療4組每只鼠口腔給予石斛0.20 g/d(0.20 g組)；治療5組每只鼠口腔給予石斛0.4g/d(0.40 g組)。1次/d。

1.4 觀察方法 實驗過程中觀察大鼠的一般情況，于干預前后分別測量血壓，并行標本采集。

1.4.1 標本采集 于實驗前后分別麻醉大鼠進行標本采集。(1)麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。(2)血液標本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打開腹腔，從腹主動脈取血0.5 mL，低溫分離取血漿。(3)腹肌標本采集：剪取腹直肌15 mm×3 mm組織，剪成5 mm×3 mm共3小塊，分別置于3個凍存管，于30 min內(nèi)液氮固定4 h，移至-70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.4.2 ELISA檢測 檢測AGE ELISA試劑盒由杭州沃森生物技術(shù)有限公司提供，用美國BIO RAD 550 型酶標儀檢測，嚴格按檢測方法和程序進行。

1.4.3 RAGE mRNA水平檢測 用RT-PCR 法，取100 μL 腹肌勻漿，用Trizol 試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10 μL 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ? μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增反應，并以β-actin 為內(nèi)參對照。根據(jù)GeneBank人RAGE基因(GeneBank登錄號AB036432)設(shè)計RAGE 基因引物，由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。RAGE基因及其管家基因序列及擴增長度，見表1。PCR反應條件: 55℃逆轉(zhuǎn)錄反應60 min，94℃變性2 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃1 min，共30循環(huán)，72℃延伸7 min。膠回收試劑盒回收目的基因片段。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物Ct 值，采用2-ΔΔCt相對定量計算公式計算分析。

表1 RAGE基因及其管家基因擴增的引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同劑量石斛多糖對SHR AGE的變化比較 治療前6組AGE平均水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后0.10 g組AGE平均水平與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與對照組比較差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.12 g組、0.14 g組、0.20 g組和0.40 g組AGE平均水平低于對照組(P<0.01，P<0.05)，也低于組內(nèi)治療前的水平(P<0.01，P<0.05)。見表2。

組別n治療前治療后P值對照組66.71±1.496.42±1.42>0.050.10g組66.67±1.434.85±1.39>0.050.12g組66.60±1.473.45±1.13??<0.010.14g組66.66±1.454.29±1.33?<0.050.20g組66.70±1.374.28±1.36?<0.050.40g組66.68±1.564.31±1.41?<0.05

注：與對照組治療后比較 *P<0.05，**P<0.01

2.2 不同劑量石斛多糖對SHR RAGE mRNA的變化比較 治療前6組RAGE mRNA平均水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后0.10 g組RAGE mRNA平均水平與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與對照組比較差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.12 g組、0.14 g組、0.20 g組和0.40 g組RAGE mRNA平均水平低于對照組(P<0.01)，也低于組內(nèi)治療前的水平(P<0.01)。見表3、圖1。

組別n治療前治療后P值對照組60.98±0.140.95±0.16>0.050.10g組60.89±0.130.69±0.21>0.050.12g組60.90±0.180.37±0.12?<0.010.14g組60.95±0.110.40±0.15?<0.010.20g組60.94±0.120.41±0.14?<0.010.40g組60.99±0.150.42±0.14?<0.01

注：*與對照組治療后比較P<0.01

3 討論

AGE在非酶促條件下，蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產(chǎn)生的一組對機體有害的物質(zhì)，與動脈粥樣硬化損傷的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)，備受關(guān)注[4]。

注：1：對照組；2：0.10 g組；3：0.12 g組；4： 0.14 g組；5：0.20 g組；6：0.40 g組

圖1石斛多糖對腹肌RAGEmRNA表達的影響

人類RAGE編碼基因位于6號染色體上，包含11個外顯子和10個較短的內(nèi)含子[5]。RAGE是一類模式識別受體，正常情況下RAGE表達量很低，當機體出現(xiàn)氧化應激時，活性氧簇產(chǎn)生增多，AGE聚集，RAGE表達量上調(diào)，激活如磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)、分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)、應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子 (signal transducers and activators of transcription, STAT)等多種信號傳導通路的級聯(lián)放大反應，并激活下游核轉(zhuǎn)錄因子(NK-κB)等，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，多量的炎癥因子釋放，導致血管通透性增高，血管收縮，單核細胞黏附，基質(zhì)成分增多等損傷，在動脈粥樣硬化損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)生作用[6-10]。阻斷應激反應所致的RAGE表達量上調(diào)，被作為防治動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的方向標[11]。

石斛藥用歷史悠久，藥用成分豐富，劑型多樣，臨床應用廣泛，用于治療眼科疾病，腸胃疾病、血栓閉塞性疾病、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、中毒和癌癥等病癥的治療，取得很好的效果，深受患者喜愛。目前普遍認為，石斛有抗炎，抗氧化，提高免疫力等功效，與其活血化瘀，行氣通絡(luò)，豁痰利氣的作用有關(guān)[12-18]。陸高翔等[12]實驗研究認為，石斛可以改善實驗大鼠慢性萎縮性胃炎(CAG)的胃黏膜血流量,提高其PGE2含量，提示其對CAG大鼠的胃黏膜有提高其屏障功能和御炎作用，對CAG有防治作用。唐漢慶等[13]實驗研究認為，鐵皮石斛具有改善心肌功能，抑制血管病理進展、減輕血管損害的作用。黃元東等[15]臨床觀察提示，鐵皮石斛可提高患者的耐中毒能力，有效改善患者的膽堿能代謝紊亂，抑制炎癥反應，減輕患者的臨床癥狀,減少并發(fā)癥的發(fā)生，促進患者康復，對急性有機磷農(nóng)藥中毒患者有輔助治療作用。動脈粥樣硬化是以動脈硬化為臨床表現(xiàn)一種的慢性血管性疾病，其特點是受累動脈病變從內(nèi)膜開始。一般先有脂質(zhì)和復合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動脈，阻塞動脈腔，造成組織或器官將缺血或壞死[19]。

最近研究認為，動脈粥樣硬化與RAGE基因功能紊亂有關(guān)[20]，中醫(yī)認為動脈粥樣硬化性疾病本為陰陽失調(diào)，標為內(nèi)生之風、痰濁和瘀血。治療上應當用活血化瘀，行氣通絡(luò)，豁痰利氣等[21]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，治療后0.12 g組、0.14 g組、0.20 g組和0.40 g組的AGE和RAGE mRNA平均水平低于對照組(P<0.01)，也低于組內(nèi)治療前的水平(P<0.01)。提示石斛多糖可以降低AGE生成和積累，抑制RAGE活化，對SHR靶器官損害起到保護性作用。

本研究結(jié)果提示，石斛多糖能有效降低SHR體內(nèi)AGEs水平，降低RAGE基因的活化，對緩解SHR的血管重塑有積極的作用。不同劑量治療組AGE和RAGE mRNA平均水平有劑量效應關(guān)系，用石斛多糖0.12 g/d才能有效控制SHR的AGE和RAGE mRNA過高的水平。