高危型HPV感染不孕癥女性患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平

李燕華， 周少雄， 薛家權(quán)

佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東佛山 528031)

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)病的病因[1]。大部分子宮頸HPV感染可通過體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答而清除，僅有一部分患者HPV感染呈現(xiàn)持續(xù)性狀態(tài)，并最終從宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為宮頸癌。HPV感染細(xì)胞的清除，主要與淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能相關(guān)[2-3]。近年來，HPV引起的感染, 尤其是在年輕婦女中生殖道感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。一些研究提示高危型HPV感染及可能導(dǎo)致的免疫功能異常是女性不孕癥的危險(xiǎn)因素之一，但研究深度不夠，結(jié)果具有爭(zhēng)議，本研究通過檢測(cè)高危型HPV感染的不孕癥女性患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和宮頸口解脲脲原體(UU)感染情況，探討其與女性不孕的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2016年1月至2018年12月就診的70例高危型HPV感染(其中24例合并UU感染)的不孕癥女性患者為觀察組進(jìn)行回顧性分析，年齡22～45歲,平均(31.23±6.08)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為已婚女性, 未避孕、有正常性生活、同居1年而未受孕者；(2)非經(jīng)期，無(wú)其他腫瘤及免疫性疾病等病史；(3)液基薄層細(xì)胞制片檢查(TCT)結(jié)果為輕度宮頸炎；(4)17種高危型人HPV(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82亞型)核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；另選取同期的70例HPV陰性的不孕癥女性患者為對(duì)照組，年齡22～44歲，平均(31.69±4.99)歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 (1)宮頸細(xì)胞標(biāo)本采集：取材前3 d內(nèi)無(wú)婦科檢査、無(wú)性生活、無(wú)陰道沖洗及陰道內(nèi)用藥；采用專用宮頸脫落細(xì)胞提取緩沖液管作為采樣容器。以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈。取出宮頸刷置于宮頸口，順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng) 4～5周，以取得足量的上皮細(xì)胞樣本，然后將宮頸刷頭部放入提取緩沖管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，擰緊管蓋，做好樣本標(biāo)識(shí)，并保持提取緩沖液管直立放置。(2)生殖道分泌物標(biāo)本采集：采集宮頸細(xì)胞標(biāo)本的同時(shí),采用無(wú)菌生殖泌尿道分泌物專用棉拭子于宮頸口處轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)秒后取出,將棉拭子置于專用容器內(nèi)密閉送檢。(3)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)標(biāo)本采集：靜脈采血2 mL，置紫色蓋EDTA-K2抗凝管，顛倒混勻3次，送檢。

1.2.2 試劑和儀器 (1)上海宏石醫(yī)療科技有限公司SLAN-96P熒光定量PCR儀及亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的17種高危型HPV核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)。(2)眾愛生河北生物科技有限公司的解脲支原體和人型支原體選擇分離培養(yǎng)、檢定、藥敏試劑盒。(3)美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BD FACSCantoII 6色流式細(xì)胞儀和BD Multitest 6-Color TBNK Reagent。

1.2.3 方法 (1)宮頸細(xì)胞標(biāo)本離心加樣，嚴(yán)格按操作規(guī)程實(shí)驗(yàn)操作，運(yùn)行HPV檢測(cè)操作程序，根據(jù)HPV檢測(cè)判別軟件，判讀檢測(cè)結(jié)果。(2)嚴(yán)格按照生殖道支原體培養(yǎng)及藥敏操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，將采集標(biāo)本拭子頭插入培養(yǎng)基液體中，充分洗滌，在瓶壁上擠干拭子，各取100 μL已接種后的培養(yǎng)基液體樣本，滴加在除(-)孔以外的各孔中， 每孔滴加1～2滴石蠟油，蓋上蓋； 將剩下的培養(yǎng)基和藥敏板在(35±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24和48 h觀察結(jié)果。當(dāng)(+)孔為陽(yáng)性，UU鑒定孔為陽(yáng)性(培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基由黃變紅、清亮無(wú)混濁)，表示UU計(jì)數(shù)(ccf≥104)有臨床意義。(3)按照TBNK淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)計(jì)數(shù)操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，鑒定標(biāo)本合格后，編管；然后加標(biāo)準(zhǔn)抗體到試管中，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)量的抗凝全血至管底，振蕩混勻，避光放置15～20 min；加入溶血素，溶解紅細(xì)胞；避光室溫至完全溶血，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。用美國(guó)BD 公司生產(chǎn)的FACS CantoII 6色流式細(xì)胞儀測(cè)定，使用FACSCanto Clinical 軟件獲取分析細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 高危型HPV感染不孕癥患者與對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，觀察組外周血NK細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05), CD3+細(xì)胞比例顯著增高(P<0.05)，B細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和CD4+/CD8+比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同組別外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

注：*與對(duì)照組比較P<0.05

對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析表明，成年女性CD4+/CD8+比值正常參考范圍為1.0～2.0，將比值≤1.1或≥1.9定義為異常，則觀察組中41.43%的患者CD4+/CD8+比值異常，其中30%比值≤1.1，11.43%比值≥1.9，2檢驗(yàn)表明，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見表2。

表2 觀察組外周血CD4+/CD8+比值分布情況 例(%)

2.2 單一感染組與合并UU感染組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果分析 在觀察組中UU合并感染率為34.29%，單一感染組外周血NK細(xì)胞、B細(xì)胞、CD3+、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+與合并UU感染組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 單一HPV感染組與合并UU感染組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

合并UU感染組CD4+/CD8+比值異常率略高于單一感染組, 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 單一HPV感染組與合并UU感染組外周血CD4+/CD8+比值分布情況 例(%)

3 討論

3.1 高危HPV感染與機(jī)體細(xì)胞免疫防御 HPV在年輕女性中的感染非常普遍，在HPV與宿主免疫系統(tǒng)的對(duì)抗中,主要是由病毒自身的或誘導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制和人體的免疫應(yīng)答機(jī)制之間的平衡來決定病變的轉(zhuǎn)歸[4-5]。細(xì)胞免疫是抗病毒免疫的主要方式，而淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞。NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分， HPV可能干擾先天免疫細(xì)胞遷移和黏附以及細(xì)胞表型的定義[6],HPV 感染患者NK細(xì)胞數(shù)量下降。B淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫, 而體液免疫在抗病毒免疫中起協(xié)同作用，觀察組中B細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T細(xì)胞是參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)并起主導(dǎo)調(diào)節(jié)的一組免疫細(xì)胞，隨著NK細(xì)胞比例下降，觀察組患者外周血中CD3+細(xì)胞的比例升高。適應(yīng)性反應(yīng)的病毒特異度T細(xì)胞由輔助性T細(xì)胞CD4+和細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD8+兩個(gè)群體組成，CD4+/CD8+的恒定比例，維持著機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡。在本研究中觀察組CD4+、CD8+細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+比值與對(duì)照組相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在觀察組中41.43%的患者出現(xiàn)CD4+/CD8+比值異常(表1、2)。可見，在高危型HPV感染的不孕婦女中部分患者的免疫平衡遭到破壞，出現(xiàn)免疫紊亂的情況。

3.2 高危HPV感染與UU感染 支原體是泌尿系感染的常見致病微生物，支原體的感染很可能會(huì)引起不孕不育，其中以UU尤為突出[7-9]。在本研究中，觀察組中UU合并感染率為34.29%，并未發(fā)現(xiàn)單一高危HPV感染組與合并UU感染組間T淋巴細(xì)胞分類的差異性，也并未發(fā)現(xiàn)兩組間CD4+/CD8+比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雖然在本研究的例數(shù)范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)合并UU感染能協(xié)同增強(qiáng)高危型HPV感染女性不孕癥患者存在的免疫功能紊亂，但從分析結(jié)果上，合并UU感染組CD4+/CD8+比值異常的比率略高于單一高危HPV感染組(表3、4)。CD4+/CD8+比值常用于評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能，當(dāng)CD4+/CD8+比值異常時(shí)，機(jī)體自身免疫能力下降，對(duì)外源性病原體的抵抗力降低，更容易發(fā)生HPV和生殖道感染。

3.3 高危型HPV感染與女性不孕癥 女性不孕癥發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，免疫因素和生殖道感染是兩大重要影響因素。性傳播感染(STI)可以針對(duì)女性生殖道沿線的不同組織導(dǎo)致其功能改變,從而導(dǎo)致生育能力下降甚至不孕[10]。HPV是最常見的性傳播感染病毒之一，對(duì)于HPV感染能否改變生殖功能尚具有爭(zhēng)議[11-14]。本觀察組中雖并未發(fā)現(xiàn)HPV感染患者外周血T細(xì)胞分類的顯著異常，但高比率的CD4+/CD8+比值異常和高比率的UU合并感染是兩個(gè)必須引起關(guān)注的問題。免疫平衡的破壞對(duì)妊娠的建立和維持均有不利影響[15]。免疫細(xì)胞分布的細(xì)微變化可能對(duì)宿主處理HPV感染和抵御其他病原體入侵的能力有重要影響[16]；同時(shí)，當(dāng)女性免疫功能異常時(shí)，可產(chǎn)生抗精子抗體并影響孕育過程[17]。另一方面，高危型HPV感染患者容易發(fā)生生殖道支原體、衣原體、真菌等病原體合并感染，可引起輸卵管炎癥、損傷和瘢痕的改變，從而導(dǎo)致輸卵管性不孕的發(fā)生[18]。

經(jīng)研究，高危型HPV感染的女性不孕患者中存在免疫紊亂的情況且與UU感染的協(xié)同病理效應(yīng)(對(duì)輸卵管影響)[19]，這些因素可能增加女性不孕的發(fā)生率。但由于本研究例數(shù)較少，該紊亂與不孕之間是否存在因果聯(lián)系有待進(jìn)一步研究闡明。盡管未能證明高危型HPV感染是否引起女性不孕的主要原因，但它必須被視為降低生育率或不育的危險(xiǎn)因素，在臨床診治時(shí)充分考慮感染者的免疫功能的變化，從而提高HPV感染治愈機(jī)會(huì)，預(yù)防宮頸癌的發(fā)生和降低不孕的發(fā)生率。