鼻咽癌患者中的miR-10b表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究*

劉春麗， 張潔， 郭霞， 梁媛， 張圣林

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1耳鼻喉科, 2腫瘤科(河北承德 067000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的發(fā)生與愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus，EBV)感染密切相關(guān)[1-2]，EBV主要通過癌蛋白潛伏膜蛋白1(LMP1)的表達(dá)促成腫瘤的發(fā)生。通過對多種腫瘤進(jìn)行的大規(guī)模的miRNA篩選顯示，LMP1可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)模式，如下調(diào)miR-203、miR-29b，上調(diào)miR-155、miR-21、miR-10b，從而對細(xì)胞遷移、增殖、凋亡產(chǎn)生多效作用[3]。體外實(shí)驗(yàn)證明LMP1通過Twist1上調(diào)了鼻咽癌細(xì)胞系C666.1中miR-10b的表達(dá)，增強(qiáng)了移動(dòng)性并促進(jìn)體外遷移和侵襲以及體內(nèi)攜帶腫瘤裸鼠的死亡[4]。鼻咽癌患者活檢組織標(biāo)本中miR-10b是否通過LMP1、Twist1調(diào)控及其與鼻咽癌增殖與遷移的關(guān)系并沒有報(bào)道。本研究通過檢測鼻咽癌活檢組織中miR-10b、LMP1、Twist1的表達(dá)情況，探討三者的相關(guān)性。通過檢測內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，評(píng)估m(xù)iR-10b在體內(nèi)對鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2017年6月至2018年9 月進(jìn)行治療的79例鼻咽癌患者，所有患者均經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性鼻咽癌，在手術(shù)前沒有接受過放療、化療或生物治療;沒有切除或轉(zhuǎn)移性疾病的病史;沒有患其他原發(fā)性腫瘤。所有患者均有完整的臨床資料。男48例，女31例；平均(46.23±2.55)歲，其中12個(gè)活檢組織標(biāo)本是青年型(年齡<30歲的患者)。鼻咽癌的臨床分期按照美國癌癥聯(lián)合會(huì)/國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)確定TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ期48例，Ⅳ期18例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。組織學(xué)類型根據(jù)世界衛(wèi)生組織2005版確定組織切片，低分化或未分化鱗狀細(xì)胞癌63例，中/高分化鱗狀細(xì)胞癌16例。其中12個(gè)活檢組織標(biāo)本是青年型(年齡<30歲的患者)。所有患者均已簽知情同意書。鼻咽癌的臨床分期按照美國癌癥聯(lián)合會(huì)/國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)確定TNM分期，組織學(xué)類型根據(jù)世界衛(wèi)生組織2005版確定組織切片。另35個(gè)來自鼻咽的正?；顧z樣本用作對照。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 TRizol試劑:英杰生命技術(shù)有限公司提供; 一抗：抗E-鈣黏蛋白，抗β-連環(huán)蛋白，抗纖連蛋白，抗N-鈣黏蛋白，抗波形蛋白和抗MMP-9(目錄號(hào)分別為ab1416; ab22656; ab6328; ab18203；ab8978; ab58803)兔抗鼠多克隆二抗抗體(目錄號(hào)ab6728)均購自美國Abcam公司。

1.3 PCR檢測miR-10b的表達(dá)水平 按照試劑說明書的步驟，用TRizol試劑裂解組織，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，取各組RNA，用紫外分光光度計(jì)測RNA濃度及OD260/260值，取OD260/280在1.8～2.0樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 于-80℃保存?zhèn)溆谩APDH作為內(nèi)參對照。GAPDH引物序列：上游為5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,下游為5′-CGCCCAATACGACCAAATCC-3′,產(chǎn)物長度122 bp，循環(huán)次數(shù)35次，退火溫度60℃。miR-10b引物序列：上游為5′-ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGAA-3′，下游為5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′，產(chǎn)物長度65 bp，循環(huán)次數(shù)40次，退火溫度61℃。用2-ΔΔCt方法對組織樣本目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.4 PCR檢測miR-10b與Twist1、LMP1表達(dá)水平 Twist1上游引物序列5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′，產(chǎn)物長度298 bp，循環(huán)次數(shù)35次，退火溫度60℃。LMP1上游引物序列5′-ACACACTGCCCTGAGGATG -3′，下游引物序列5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′，產(chǎn)物長度298 bp，循環(huán)次數(shù)35次，退火溫度60℃。RNA提取方法和每個(gè)樣本的相對表達(dá)量分析同1.3。根據(jù)Twist1和LMP1的相對表達(dá)水平，將79例鼻咽癌患者分為3組，第一組(即組1)為Twist1陰性表達(dá)，與LMP1的表達(dá)譜無關(guān)的病例，共35例。第二組(即組2)為Twist1陽性表達(dá)和LMP1的陰性表達(dá)的病例，共19例。第3組(即組3)為Twist1和LMP1同時(shí)陽性表達(dá)的病例，共25例。用PCR檢測miR-10b 與Twist1、LMP1的表達(dá)水平，分析三者的相關(guān)性。

1.5 Western法檢測E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、纖連蛋白、N-連環(huán)蛋白、波形蛋白和MMP-9水平 按照試劑盒說明書，用裂解液裂解各組的標(biāo)本，BCA 法測定蛋白濃度，各樣品上樣量20 μg，在10%分離膠(恒壓120 V)和5%濃縮膠(恒壓80 V)中進(jìn)行電泳，2 h后將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。一抗(稀釋液濃度1∶1 500) 室溫下孵育膜1 h，常規(guī)洗滌。然后將膜與二抗(稀釋液濃度1∶2 500)一起溫育1 h，常規(guī)洗滌，顯影。使用全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)記錄免疫印跡結(jié)果。每個(gè)條帶的密度用凝膠成像分析系統(tǒng)確定，β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參。計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-10b在鼻咽癌活檢組織和鼻咽正常組織的表達(dá)水平 鼻咽癌活檢組織中miR-10b的相對表達(dá)水平是88.6±0.75，正常組織miR-10b的相對表達(dá)水平是3.56±0.46，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-10b的表達(dá)水平與Twist1和LMP1的相關(guān)性分析 79個(gè)原發(fā)性鼻咽癌活組織樣本分別檢測到33例和46例Twist1和LMP1的陽性表達(dá)。在鼻咽正常組織樣本中, 所有35例患者的LMP1表達(dá)均為陰性，而僅在4例患者中檢測到Twist1。本研究發(fā)現(xiàn)Twist1和LMP1陽性病例與miR-10b過表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)。如表1所示，同時(shí)表達(dá)LMP1和Twist1的病例(第3組)與只有Twist1陽性表達(dá)(第2組)和Twist1陰性表達(dá)(第1組)的病例相比較, miR-10b mRNA的相對表達(dá)水平更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(組2和組3比較P=0.035，組1和組3比較P=0.013)。

2.3 上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平 Western印跡分析法檢測鼻咽癌組織、鼻咽正常組織中上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平。如表2所示，鼻咽癌組織中E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平顯著低于鼻咽正常組織(P<0.05)。鼻咽癌組織中纖連蛋白、N-連環(huán)蛋白、波形蛋白和MMP-9的表達(dá)水平高于沒有miR-10b表達(dá)的鼻咽正常組織(P<0.05)。

表1 分組后每組miR-10b的相對表達(dá)水平

注：*與組3比較P<0.05

表2 鼻咽癌組織和正常組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平

注：*與正常組織比較P<0.05

3 討論

鼻咽癌是鼻咽黏膜的惡性腫瘤，伴有早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部侵襲，在我國的廣東、廣西發(fā)病率很高[5]。目前隨著診斷和治療方法的改進(jìn)，大多數(shù)早期鼻咽癌患者已成功治愈。然而，大多數(shù)中晚期患者由于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移5年生存率極低。資料顯示30%～40%的鼻咽癌患者會(huì)在4年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后預(yù)后變差，且易引起復(fù)發(fā)[6]。其原因是包括鼻咽癌細(xì)胞在內(nèi)的癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移后，促進(jìn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，以上皮標(biāo)志物喪失-間充質(zhì)標(biāo)志物增多為特征，從而加速了遷移和侵襲[7-8]。

EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和入侵能力的一種重要的生物學(xué)細(xì)胞過程。EMT后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞增多、增厚，表面纖維和偽足增加。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖維蛋白，N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)增加，增強(qiáng)了細(xì)胞遷移能力和腫瘤轉(zhuǎn)移的能力[9-10]。EMT后，處于靜止?fàn)顟B(tài)的上皮細(xì)胞變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞后即具有很強(qiáng)的遷移能力。此外，蛋白水解酶，如MMP-9，可以降解基底膜，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞侵入細(xì)胞外基質(zhì)中。鼻咽癌細(xì)胞在EMT的過程中，這些細(xì)胞標(biāo)記物有類似的變化，盡管導(dǎo)致這些變化的機(jī)制仍不清楚，但在轉(zhuǎn)移進(jìn)展的早期階段起著關(guān)鍵作用。因此，更好地了解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子模式，尋找有效的靶向治療，盡可能地減少腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，對于開發(fā)有效的治療鼻咽癌的新策略，更好地治療中晚期鼻咽惡性腫瘤是至關(guān)重要的。

微小RNA(miRNA)是一種高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞途徑，除具有與細(xì)胞生長發(fā)展和分化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能外，也充當(dāng)癌基因或腫瘤抑制因子[11]。在鼻咽癌患者中，已觀察到失調(diào)的miRNA表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)特異性miRNA的異常表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)。目前，發(fā)現(xiàn)了35種miRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中包括miR-10b[12]。

Horikawa等[13]在鼻咽癌細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)， EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1在細(xì)胞培養(yǎng)模型中通過NF-κB途徑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Twist1的過表達(dá)，導(dǎo)致鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，Li等[14]報(bào)道了miR-10b在C666-1 鼻咽癌細(xì)胞系中，EB病毒陽性的潛伏膜蛋白-1(LMP1)表達(dá)誘導(dǎo)Twist1表達(dá)高水平的miR-10b，miR-10b的上調(diào)又增加了細(xì)胞的移動(dòng)性，但在LMP1沉默的C666.1細(xì)胞中如果誘導(dǎo)miR-10b過表達(dá)，也可以明顯促進(jìn)體外傷口愈合和跨膜侵襲以及體內(nèi)攜帶腫瘤裸鼠的死亡[15]。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-10b在體外可促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。但在鼻咽癌患者體內(nèi)miR-10b是否也可以通過LMP1及Twist1促進(jìn)癌組織的生長與擴(kuò)散并無報(bào)道。

本研究通過檢測鼻咽癌患者鼻咽組織及正常人鼻咽組織發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者鼻咽組織中miR-10b高表達(dá)，明顯高于正常組，且miR-10b在組3(Twist1和LMP1同時(shí)陽性)的表達(dá)明顯高于單陽性組2(Twist1陽性LMP1陰性)或陰性組1(Twist1陰性)(分別為P=0.035，P=0.013)。即表達(dá)/或不表達(dá)Twist1與同時(shí)表達(dá)LMP1和Twist1的樣品miR-10b具有顯著的區(qū)別。結(jié)果表明LMP1促成miR-10b的過表達(dá)，與鼻咽癌細(xì)胞系的研究[15]結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)低于正常鼻咽上皮組織，而基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖連蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和MMP-9的表達(dá)明顯高于鼻咽上皮組織。上皮細(xì)胞標(biāo)志物的減少，可以減弱細(xì)胞-細(xì)胞黏附，從而減少細(xì)胞黏附和增加細(xì)胞基底膜運(yùn)動(dòng)。而基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的增加，可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移能力，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和凋亡[16]。已知轉(zhuǎn)錄因子KLF4是miR-10b的直接靶點(diǎn)，miR-10b可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子KLF4來調(diào)節(jié)EMT[17]，結(jié)果說明在鼻咽癌患者體內(nèi)過表達(dá)的miR-10b促進(jìn)了癌細(xì)胞的EMT。

總之，鼻咽癌活檢組織標(biāo)本中高水平的LMP1和Twist1的同時(shí)表達(dá)可以誘導(dǎo)miR-10b高表達(dá)，即LMP1通過轉(zhuǎn)錄因子Twist1上調(diào)miR-10b的水平。miR-10b的升高可以使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)下降，使細(xì)胞-細(xì)胞黏附能力減弱，增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物纖連蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和MMP-9增加，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，來促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究為miR-10b作為治療鼻咽癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為開發(fā)新的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。