選擇性剪接在卵巢癌中的研究進(jìn)展

徐 蕾，黃驍昊，張智弘，戴輝華

卵巢癌是一組異質(zhì)性的惡性腫瘤，不同亞型在病因、分子生物學(xué)和許多其他特征上均有所不同，是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率高居?jì)D科腫瘤之首[1]。全球每年約有239 000例新發(fā)病例(占所有癌癥的3.6%)和152 000例死亡病例(占所有癌癥死亡人數(shù)的4.3%)[2]。2015年中國(guó)腫瘤數(shù)據(jù)顯示，約有52 100個(gè)新發(fā)卵巢癌病例以及約有22 500人死于該疾病[3]。由于卵巢癌早期癥狀不明顯以及缺乏有效的篩查手段，約70%的患者一經(jīng)診斷已是晚期，許多患者通常是在腹腔多發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生很久之后才出現(xiàn)癥狀。越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因會(huì)發(fā)生剪接異常，從而產(chǎn)生致癌或抑癌蛋白。目前卵巢癌中已經(jīng)有許多異常的選擇性剪接被發(fā)現(xiàn)，理解這些異常剪接發(fā)生的分子機(jī)制有可能為卵巢癌的治療提供新線索。

1 選擇性剪接

RNA剪接主要發(fā)生在細(xì)胞核的剪接體，是將不成熟的mRNA前體中的內(nèi)含子去除并將外顯子連接在一起生成成熟的mRNA，其過(guò)程依賴于順式作用元件和反式調(diào)節(jié)因子調(diào)控[4]。RNA剪接的核心 — 剪接體，是由蛋白質(zhì)和核內(nèi)小RNA(snRNA)組成的大分子復(fù)合物，在mRNA前體的外顯子-內(nèi)含子邊界的特定序列上組裝，并定義3′和5′的剪接位點(diǎn)(SSs)和分支點(diǎn)的位點(diǎn)(BPS)，其結(jié)構(gòu)在整個(gè)剪接反應(yīng)過(guò)程中經(jīng)歷動(dòng)態(tài)重塑。除核心剪接體外，還有調(diào)控蛋白參與調(diào)控剪接反應(yīng)，并通過(guò)與外顯子或內(nèi)含子的增強(qiáng)子或沉默子元件結(jié)合起剪接激活因子或抑制因子的作用[4]。

剪接過(guò)程中主要由剪接位點(diǎn)介導(dǎo)外顯子的識(shí)別，輔助性剪接因子可以推動(dòng)剪接體對(duì)剪接位點(diǎn)的識(shí)別決定留下還是切除某些外顯子，因此剪接過(guò)程是多變的，這就是選擇性剪接發(fā)生的機(jī)制。選擇性剪接是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制之一，約95%的具有外顯子的人類基因存在選擇性剪接[5]。選擇性剪接的類型并不單一，主要有五種類型：外顯子跳躍式(也稱為盒外顯子)、互斥外顯子、選擇性5′或3′剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子保留。

選擇性剪接不僅在正常的生理過(guò)程(包括造血、大腦發(fā)育、肌肉功能)，甚至在許多疾病(如腫瘤)中均是重要的發(fā)生機(jī)制之一。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，選擇性剪接參與了腫瘤的增殖、凋亡、缺氧、血管生成、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。更重要的是，腫瘤微環(huán)境在一定數(shù)量剪接因子的作用下會(huì)發(fā)生特異性的選擇性剪接改變[6]，剪接因子表達(dá)的改變可能導(dǎo)致腫瘤選擇性剪接信號(hào)的整體改變[7-8]；在某些情況下，剪接因子的突變可產(chǎn)生一種特定的促癌剪接亞型[9]。因此，選擇性剪接為許多生物過(guò)程提供了一個(gè)關(guān)鍵且靈活的調(diào)控層面，而對(duì)選擇性剪接的深入研究，可能會(huì)為腫瘤提供潛在的診斷和治療的生物標(biāo)志物[10]。選擇性剪接事件在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和肺癌患者中的預(yù)后價(jià)值已被報(bào)道[11-13]。目前已經(jīng)有一些研究通過(guò)比較正常卵巢組織和癌組織的方法提出了卵巢癌中一些特異性選擇性剪接事件，但尚未有對(duì)卵巢癌中選擇性剪接事件的系統(tǒng)性回顧，該文就卵巢癌的選擇性剪接進(jìn)行具體的闡述，并評(píng)估選擇性剪接在卵巢癌中的預(yù)后、診斷及治療的潛力。

2 卵巢癌中的選擇性剪接事件

2.1 選擇性剪接在卵巢癌血管生成中的作用L1CAM又稱CD171或L1，是由L1CAM基因編碼的細(xì)胞黏附分子。其是一種細(xì)胞表面糖蛋白，其胞外部分包括6個(gè)類胰島素樣結(jié)構(gòu)域、5個(gè)纖維連接蛋白Ⅲ型重復(fù)序列、一個(gè)短跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的胞質(zhì)尾區(qū)。L1CAM最初是在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，并因其在神經(jīng)發(fā)育和可塑性方面的重要功能而被描述。進(jìn)一步研究表明，L1CAM的表達(dá)并不局限于神經(jīng)系統(tǒng)，其在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等幾種不同腫瘤的血管系統(tǒng)中也均有表達(dá)，而在正常血管中沒(méi)有或只有非常低的表達(dá)[14]。L1CAM在腫瘤相關(guān)血管內(nèi)具有不同的內(nèi)皮細(xì)胞功能，如通透性、周細(xì)胞覆蓋率和極性，由于這些細(xì)胞過(guò)程影響腫瘤血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，L1CAM已成為腫瘤血管特異性治療的潛在靶點(diǎn)。L1CAM主要有兩種可變剪接亞型：神經(jīng)元通常表達(dá)L1CAM的全長(zhǎng)亞型，而非神經(jīng)元細(xì)胞則產(chǎn)生缺乏外顯子2和27的較短亞型。外顯子2可以與其他神經(jīng)元蛋白相互作用，而外顯子27促進(jìn)L1CAM的內(nèi)吞作用[15]。

神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原2(neuro-oncological ventral antigen 2, NOVA2)是血管發(fā)育過(guò)程中選擇性剪接的重要調(diào)節(jié)因子[16]。NOVA2最初在神經(jīng)細(xì)胞中被識(shí)別，其通過(guò)與其靶標(biāo)pre-mRNA內(nèi)的YCAY(Y=C/U)重復(fù)簇結(jié)合來(lái)控制多個(gè)參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程的基因的選擇性剪接。NOVA2也在血管內(nèi)皮中表達(dá)，并在血管生成過(guò)程中受到調(diào)控[16]。NOVA2在轉(zhuǎn)錄后水平控制內(nèi)皮細(xì)胞極性的建立，這一過(guò)程對(duì)血管腔的形成至關(guān)重要，因此對(duì)血管生成也至關(guān)重要[17]，相應(yīng)地，NOVA2缺失會(huì)造成體內(nèi)血管形成的缺陷。而在卵巢癌血管中，NOVA2的表達(dá)明顯上調(diào)，且NOVA2的表達(dá)僅在卵巢癌的血管內(nèi)皮中檢測(cè)到，特別是在內(nèi)皮細(xì)胞胞核中。通過(guò)對(duì)卵巢癌的生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，與低表達(dá)NOVA2的患者相比，高表達(dá)NOVA2的患者具有較短的生存期[18]。

Angiolini等[18]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)L1CAM外顯子25跳躍會(huì)產(chǎn)生一種在細(xì)胞外基質(zhì)釋放的新的可溶性蛋白質(zhì)亞型L1-ΔTM，其具有顯著誘導(dǎo)新生血管生成的作用。值得注意的是，在腫瘤血管中NOVA2水平的升高常常伴隨著L1-ΔTM的表達(dá)升高，而且過(guò)表達(dá)NOVA2會(huì)促進(jìn)L1CAM外顯子25的跳躍。也就是說(shuō)，NOVA2可促進(jìn)卵巢癌血管中L1CAM pre-mRNA的選擇性剪接，這也就解釋了L1-ΔTM在腫瘤血管中高表達(dá)的原因，這些證據(jù)表明NOVA2是卵巢癌新生血管形成的潛在驅(qū)動(dòng)因素。事實(shí)上，干擾細(xì)胞表面L1CAM的功能，同時(shí)干擾細(xì)胞外L1-ΔTM的功能，可能會(huì)有效抑制腫瘤血管生成，為卵巢癌的治療提供新方向。

2.2 選擇性剪接在卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用CTNNBL1是一種廣泛表達(dá)的核蛋白，與剪接體的Prp19復(fù)合物結(jié)合，并與其組成部分CDC5L相互作用[19]。Prp19是一種在剪接體的催化激活過(guò)程中起作用的復(fù)合物。Li等[20]揭示CTNNBL1在高級(jí)別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer, HGSOC)組織和卵巢癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，且在HGSOC患者中，CTNNBL1的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。

全基因組轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CTNNBL1在卵巢癌細(xì)胞中調(diào)控多種剪接事件和基因表達(dá)，其中干擾素γ誘導(dǎo)蛋白16(interferon-inducible protein 16, IFI16)在HGSOC中顯著下調(diào)。Western blot分析表明無(wú)論在CTNNBL1過(guò)表達(dá)還是敲低的卵巢癌細(xì)胞中，CTNNBL1都負(fù)調(diào)控IFI16的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)的IFI16可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。通過(guò)在A2780細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CTNNBL1，發(fā)現(xiàn)IFI16的剪接亞型顯著減少。綜上所述，IFI16與卵巢癌細(xì)胞功能相關(guān)，而CTNNBL1調(diào)控IFI16的表達(dá)和選擇性剪接。

FOXM1是FOX家族基因成員之一，是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。由于外顯子Va和Ⅶa的選擇性剪接，F(xiàn)OXM1蛋白共有3種亞型，其中FOXM1B和FOXM1C起轉(zhuǎn)錄激活作用，而FOXM1A無(wú)轉(zhuǎn)錄活性[21]。Li等[20]發(fā)現(xiàn)在HO8910卵巢癌細(xì)胞中敲降CTNNBL1后，F(xiàn)OXM1B和FOXM1C的表達(dá)下降，而FOXM1A的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示CTNNBL1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中FOXM1的選擇性剪接，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是胚胎發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要的一步，但在癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中被異常激活，EMT促進(jìn)了癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移的能力，而間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition, MET)則被認(rèn)為是癌細(xì)胞在遠(yuǎn)處再定植的必要驅(qū)動(dòng)力。上皮剪接調(diào)控因子1(epithelial splicing regulatory protein 1, ESRP1)在正常上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在侵襲早期表達(dá)下調(diào)，并會(huì)在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和定植的淋巴結(jié)中重新表達(dá)。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)ESRP1在上皮性卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)，并且證實(shí)了在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期，下調(diào)的ESRP1可以誘導(dǎo)EMT，調(diào)控CD44 mRNA的選擇性剪接，促進(jìn)CD44v向CD44s轉(zhuǎn)換，以增強(qiáng)上皮性卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。由于EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展中的早期步驟，了解ESRP1等剪接因子在調(diào)節(jié)EMT中的作用可能會(huì)提高臨床預(yù)防卵巢癌進(jìn)展的能力。

原癌基因受體(proto-oncogene recepteur d'origine nantais, RON)編碼巨噬細(xì)胞刺激蛋白的跨膜酪氨酸激酶受體(macrophage-stimulating protein, MSP)，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附、增殖、凋亡、EMT等多種腫瘤生物學(xué)過(guò)程中起重要作用[23]。Mayer等[24]通過(guò)對(duì)45例卵巢癌組織和4例正常卵巢組織研究發(fā)現(xiàn)，RON在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在正常卵巢組織中未檢測(cè)到表達(dá)。除了成熟的RON，目前RON共有6種選擇性剪接的亞型。其中，相較于其他RON的剪接亞型，選擇性切除外顯子11產(chǎn)生的RONΔ165在卵巢癌中更為常見(jiàn)，其次是RONΔ160或RONΔ155(選擇性切除外顯子5或6)，說(shuō)明這些亞型可能在卵巢癌發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中起著更為重要的作用。因此，RON表達(dá)譜的改變可能成為治療卵巢癌的有利靶點(diǎn)，如化學(xué)抑制劑或針對(duì)癌癥相關(guān)RON剪接亞型的特異性抗體有可能為卵巢癌的治療提供新的思路。

2.3 選擇性剪接在卵巢癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化受程序性細(xì)胞死亡或凋亡的控制，其中一個(gè)主要的凋亡通路是由Fas受體(Fas)-Fas配體(FasL)相互作用觸發(fā)的。Fas是一種屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的跨膜蛋白，其與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞常常通過(guò)下調(diào)Fas來(lái)逃避Fas信號(hào)，并產(chǎn)生與FasL結(jié)合的可溶性Fas蛋白(sFas)，從而阻斷細(xì)胞凋亡。sFas是Fas pre-mRNA一種選擇性剪接產(chǎn)物，通常由切除外顯子6(FasΔEx6)編碼的跨膜生成序列產(chǎn)生[25]。

剪接因子45(splicing factor 45, SPF45)是剪接體的組成部分，是一種新的剪接因子，作用于內(nèi)含子去除的第二催化步驟。其通過(guò)識(shí)別內(nèi)含子內(nèi)的近端AGs參與選擇性剪接。其也可以識(shí)別遠(yuǎn)端AGs，并可能在剪接中有其他未知的作用[26]。SPF45在大多數(shù)組織中低表達(dá)，在內(nèi)含子中識(shí)別和激活3′剪接位點(diǎn)的AG。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，SPF45調(diào)控Fas第6外顯子的剪接，并且通過(guò)敲除SPF45發(fā)現(xiàn)減少了sFas的產(chǎn)生、增加了Fas在細(xì)胞表面的積累以及細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性[25]。SPF45在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中均過(guò)表達(dá)，其作用可能與增殖、化療耐藥[26]以及細(xì)胞遷移和侵襲[27]有關(guān)。因此，通過(guò)敲除SPF45，有可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。

2.4 選擇性剪接在卵巢癌化療耐藥中的作用目前，卵巢癌的治療主要采用手術(shù)結(jié)合靜脈化療的方法，其中化療不僅可以縮小病灶，并能顯著延緩其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。紫杉醇和鉑類是目前用于卵巢癌的臨床化療的主要藥物。然而，由于個(gè)體體質(zhì)和對(duì)化療的敏感性不同，不同患者接受相同的化療方案獲得的療效也可能不同。化療的治療潛力受耐藥的限制，耐藥既可能是先天的，也可能是后天獲得的；可能是單藥耐藥，也可能是多藥耐藥。

多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)最初是從耐藥肺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，是與多藥耐藥相關(guān)的ATP結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporter subfamily, ABCC)的典型成員之一。MRP1在正常組織中廣泛表達(dá)，可主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)多種內(nèi)源性、外源性共軛或非共軛有機(jī)陰離子[28]。研究表明，MRP1在腫瘤細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)可通過(guò)減少細(xì)胞中藥物的積累，使其對(duì)許多天然產(chǎn)物化療藥物如蒽環(huán)類藥物、長(zhǎng)春花生物堿和表多巴葉毒素產(chǎn)生耐藥性。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MRP1 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，在化療耐藥組中的表達(dá)明顯高于化療敏感組[29]。He等[28]通過(guò)Ⅲ期或Ⅳ期卵巢癌組織和正常卵巢組織對(duì)比，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中MRP1剪接亞型的平均表達(dá)量是正常組織的2倍，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MRP1剪接亞型的增多與剪接因子PTB和SRp20過(guò)表達(dá)相關(guān)，該研究揭示了卵巢癌中MRP1外顯子10和19之間的跳躍事件很可能是PTB的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的，而SRp20過(guò)表達(dá)則通過(guò)促進(jìn)對(duì)位于內(nèi)含子內(nèi)的弱外顯子的識(shí)別而產(chǎn)生更多的MRP1剪接亞型。然而關(guān)于MRP1選擇性剪接的具體機(jī)制還有待深入研究，能夠更好地理解耐藥的生物學(xué)機(jī)制將為治療干預(yù)和個(gè)體化治療提供新的選擇。

3 結(jié)語(yǔ)

選擇性剪接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、血管生成和耐藥密切相關(guān)。卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，嚴(yán)重危害廣大婦女的生命健康，雖然近年來(lái)治療方案不斷改進(jìn)，但患者的5年生存率依然提升緩慢，因此深入了解選擇性剪接在卵巢癌進(jìn)展中扮演的角色及發(fā)生機(jī)制，有助于從新的角度尋找早期診斷卵巢癌的生物標(biāo)志物，提供卵巢癌治療的新靶點(diǎn)，改善患者的耐藥及預(yù)后，提高卵巢癌患者的生活質(zhì)量。