疑難肝病的基因診斷

庫爾班江·阿布都西庫爾 王建設(shè)

隨著人民生活水平的改善、病毒性肝炎預(yù)防及診治水平的提高，感染性肝病的發(fā)病率逐年下降。近年來生物科技的迅速發(fā)展，越來越多的肝病分子生物基礎(chǔ)得以明確，遺傳性肝病已成為肝病常見的病因之一[1]。1989年囊性纖維化致病基因(CFTR)的發(fā)現(xiàn)開啟了肝病分子機(jī)制研究的新篇章。上世紀(jì)90年代相繼發(fā)現(xiàn)了高膽紅素血癥(UGT1A1及ABCC2)、肝豆?fàn)詈俗冃?ATP7B)、血色病(HFE)、Alagille綜合征(JAG1)及進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥(ATP8B1、ABCB11及ABCB4)等致病基因[2]。基因診斷技術(shù)在過去的30年見證了肝病分子機(jī)制的巨大突破。近年來國內(nèi)基因診斷技術(shù)快速普及，越來越多的重癥或疑難肝病患者不但得以確診，也受益于針對(duì)病因的有效治療措施。本課題組先后在國內(nèi)首次報(bào)道多種進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥(PFIC)[3-5]、Alagille綜合征[6]及膽汁酸合成缺陷[7-8]。2017年及2020年先后首次在國際上報(bào)道MYO5B、USP53及ZFYVE19等新基因引起的遺傳性肝病[9-11]。此外，本課題組在國內(nèi)首次報(bào)道了其他罕見遺傳性肝病的新突變或新表型[12-19]。本文將闡述肝病基因診斷的意義、肝病基因診斷思路及將來面臨的挑戰(zhàn)。

一、肝病基因診斷的意義

1.基因診斷可幫助理解肝病的發(fā)病機(jī)制

1993年及1996年分別克隆出了肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)和遺傳性血色病致病基因，并明確兩者為單基因肝病。ATP7B基因功能研究發(fā)現(xiàn)其金屬結(jié)合區(qū)域與原核細(xì)胞重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體類似，從而進(jìn)一步研究得知銅轉(zhuǎn)運(yùn)在Wilson病發(fā)病機(jī)制中的重要作用。同樣，血色病相關(guān)基因(HFE、SLC40A1、TFR2、HAMP及HJV)的發(fā)現(xiàn)及功能研究不僅為了解肝臟鐵代謝及調(diào)控奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)，亦明確了相關(guān)基因突變導(dǎo)致血色病的病理生理機(jī)制。肝病第一次全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)是針對(duì)膽結(jié)石進(jìn)行的，ABCG5及ABCG8基因是重要易感基因，后續(xù)關(guān)于自身免疫性肝病的GWAS研究發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)與原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)及自身免疫性肝炎(AIH)相關(guān)的基因位點(diǎn)。多數(shù)基因位點(diǎn)與其他自身免疫性或免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)位點(diǎn)重合，提示自身免疫性肝病可能僅僅是自身免疫性疾病的肝臟表現(xiàn)。高?；蛭稽c(diǎn)與主要組織相容性抗原(MHC)關(guān)系密切，提示PBC、PSC及AIH的病理生理機(jī)制與后天性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)。然而，基因突變對(duì)自身免疫性肝病的貢獻(xiàn)不足10%，50%以上的易感性可能來自環(huán)境因素。近年來，全外顯子組測(cè)序(WES)技術(shù)成功應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)不明原因兒童肝衰竭等疑難肝病基因基礎(chǔ)。也有之前未曾懷疑線粒體肝病的肝衰竭患兒檢查WES后發(fā)現(xiàn)MPV17及SERAC1等基因突變。近期研究結(jié)果表明部分膽管受累及肝細(xì)胞脂肪變性的肝病與先天性糖基化障礙有關(guān)，提示糖基化異常可導(dǎo)致膽管發(fā)育異常及肝細(xì)胞能量代謝障礙[20]。

2.基因診斷可明確肝病亞型

50年前報(bào)道的Byler病表現(xiàn)為嚴(yán)重程度不一的肝病，可表現(xiàn)為嬰兒期發(fā)病的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥(PFIC)，在成人期前可以發(fā)展為肝纖維化或終末期肝病。在過去20年的基礎(chǔ)研究中相繼發(fā)現(xiàn)并克隆出了負(fù)責(zé)肝細(xì)胞頂端膜攝取、毛細(xì)膽管膜分泌膽汁酸及其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前已知的PFIC亞型有PFIC-1型(ATP8B1缺陷病)、PFIC-2型(ABCB11缺陷病)、PFIC-3型(ABCB4缺陷病)、PFIC-4型(TJP2缺陷病)、PFIC-5型(NR1H4缺陷病)及PFIC-6型(MYO5B缺陷病)。本課題組不僅在國內(nèi)首次報(bào)道PFIC-1型[3]、PFIC-2型[4]及PFIC-3型[5]，在國際上首次發(fā)現(xiàn)的MYO5B[9]、USB53[10]及ZFYVE19[11]等為嬰兒膽汁淤積癥致病的基因。同樣以直接膽紅素升高為主的高膽紅素血癥可以通過基因診斷分為ABCC2基因突變導(dǎo)致的Dubin-Johnson綜合征及SLCO1B1/SLCO1B3雙基因突變引起的Rotor綜合征。以間接膽紅素升高為主的高膽紅素血癥通過臨床表型及UGT1A1基因突變類型可分為Gilbert綜合征、Crigler-Najjar綜合征2型及Crigler-Najjar綜合征1型[21]。Alagille綜合征可分為JAG1基因突變引起的1型及NOTCH2基因突變引起的2型。

3.基因診斷可幫助肝病分類

脂肪肝通常是因飲酒或肥胖引起，化療及其他藥物也可引起脂肪肝。僅10%～20%的飲酒或肥胖人群會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重脂肪肝、嚴(yán)重肝纖維化或肝硬化。GWAS發(fā)現(xiàn)PNPLA3基因p.I148M變異與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，也會(huì)增加酒精性脂肪肝病的嚴(yán)重程度。p.I148M變異在歐洲人群中頻率較高(21%～28%)，該位點(diǎn)的變異會(huì)增加3倍的NASH患病風(fēng)險(xiǎn)，增加12倍的肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)?？茖W(xué)家們建議攜帶PNPLA3基因變異的NASH患者進(jìn)一步分類為PNPLA3相關(guān)脂肪肝炎(PASH)，加強(qiáng)生活方式及飲食方面的干預(yù)，提前預(yù)防病情加重。目前已知近200個(gè)基因與纖毛功能異常有關(guān)，常表現(xiàn)為先天性肝纖維化(肝功能正常的門脈高壓癥)、膽管擴(kuò)張、肝囊腫或慢性膽汁淤積性肝硬化，可合并腎囊腫、慢性腎功能不全、慢性肺病、不孕癥、腦積水、聽力異常及視網(wǎng)膜病變。這類疾病由膽管板發(fā)育不良導(dǎo)致，統(tǒng)稱為纖毛病(又稱肝腎纖維囊性病變或膽管板發(fā)育不良)，治療原則為利膽治療[22]。

4.基因診斷可幫助肝病治療

GWAS研究發(fā)現(xiàn)編碼干擾素λ3的IL28B基因變異與慢性丙型病毒性肝炎患者干擾素治療應(yīng)答相關(guān)。IL28B及IL29基因變異不僅與丙型肝炎病毒(HCV)感染自愈相關(guān)，也決定了病毒性肝炎的嚴(yán)重程度。與NASH危險(xiǎn)因素相關(guān)的PNPLA3及TM6SF2等基因也與影響心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。關(guān)于阿莫西林克拉維酸鉀相關(guān)的特發(fā)性藥物性肝損傷(DILI)的GWAS研究發(fā)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原(HLA)相關(guān)區(qū)域與DILI發(fā)病有關(guān)，提示人體對(duì)藥物本身、藥物代謝產(chǎn)物或藥物誘導(dǎo)的抗原會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，早期糖皮質(zhì)激素治療可能有效阻斷肝病進(jìn)展。基因確診后的肝病患者接受針對(duì)病因的治療可延緩病情進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)肝臟病變，大大改善了患者預(yù)后及生存質(zhì)量，如膽汁淤積癥利膽及補(bǔ)充脂溶性維生素治療、膽汁酸合成缺陷補(bǔ)充初級(jí)膽汁酸、肝豆?fàn)詈俗冃耘陪~、遺傳性血色病排鐵或放血、肝糖原累積病飲食治療等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)特定基因或特定突變類型的治療措施可能會(huì)逐漸成為現(xiàn)實(shí)，如影響蛋白折疊的錯(cuò)義突變可通過分子伴侶治療改善蛋白功能[23]、終止碼突變使用小分子“readthrough”治療可能會(huì)達(dá)到基因繼續(xù)翻譯的目的[24]。

二、肝病的基因診斷思路

1.肝病的臨床表現(xiàn)可作為基因診斷的重要線索

肝病的臨床表現(xiàn)多樣，包括轉(zhuǎn)氨酶升高、高膽紅素血癥、膽汁淤積癥、肝功能衰竭、肝腫大、肝硬化、肝纖維化、門脈高壓、低蛋白血癥、腹腔積液、凝血功能異常、瘙癢及肝臟腫瘤等，也可有肝外器官系統(tǒng)受累。以膽汁淤積癥為主要表現(xiàn)的患者根據(jù)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)水平高低分別篩查低GGT膽汁淤積癥相關(guān)PFIC-1、2、4、5、6型等相關(guān)基因及高GGT相關(guān)PFIC-3型基因。以轉(zhuǎn)氨酶升高、肝腫大及低血糖為主要表現(xiàn)的肝病患者應(yīng)首選排查糖原累積病相關(guān)基因。嬰幼兒期急性或反復(fù)發(fā)熱相關(guān)肝功能衰竭患者應(yīng)排查NBAS、RINT1及SCYL1等基因。以肝脾腫大、神經(jīng)系統(tǒng)及肺部疾病為主要表現(xiàn)的患者應(yīng)排查溶酶體病相關(guān)基因[25]。

2.肝病基因診斷對(duì)象的選擇

所有不明原因肝病及肝膽受累的多系統(tǒng)疾病患者，除外感染、免疫、藥物及解剖異常等因素后應(yīng)排查遺傳性肝病可能。臨床已確診非遺傳性肝病但治療效果不如預(yù)期或出現(xiàn)不明原因的并發(fā)癥者也應(yīng)考慮盡早進(jìn)行基因診斷，排查潛在或合并存在的基因異常[1]。

3.肝病基因診斷方法的選擇

(1)單基因Sanger測(cè)序：適用于明確懷疑單基因突變的肝病患者，如肝豆?fàn)詈俗冃?、Alagille綜合征、Citrin缺陷病及高膽紅素血癥等，也適用于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證；(2)多基因芯片(Panel)測(cè)序：適用于懷疑牽涉多個(gè)基因的某個(gè)代謝通路功能障礙引起的肝病患者，如糖原累積病、血色病、膽汁淤積癥及膽汁酸合成障礙等；(3)WES：適用于明確懷疑遺傳性肝病、但未能通過單基因或多基因芯片等測(cè)序方法找到致病基因的患者；(4)全基因組測(cè)序(WGS)：適用于WES檢查未能確診、懷疑內(nèi)含子區(qū)突變或結(jié)構(gòu)性變異導(dǎo)致肝病的患者；(5)線粒體基因測(cè)序：適用于懷疑線粒體肝病但WES或Panel測(cè)序未能找到影響線粒體功能的核基因突變患者；(6)單基因或全基因組拷貝數(shù)變異：適用于懷疑特定基因或染色體片段拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的肝病患者；(7)快速WES或WGS檢查：可在數(shù)天內(nèi)篩查遺傳性疾病，能夠幫助指導(dǎo)急危重患者得到及時(shí)有效的診治。隨著二代基因測(cè)序成本下降，既往單基因Sanger測(cè)序已被肝病相關(guān)多基因靶向測(cè)序所替代。相信在不久的將來，WES及WGS可能成為遺傳性肝病常規(guī)篩查手段。

4.正確解讀基因報(bào)告

應(yīng)由熟悉患者臨床表現(xiàn)、發(fā)生突變的基因及基因突變性質(zhì)的遺傳性肝病?？漆t(yī)生解讀基因報(bào)告。判斷基因變異的致病性應(yīng)遵循美國遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)相關(guān)指南[26]，務(wù)必結(jié)合患者臨床表型綜合判斷?；驒z查發(fā)現(xiàn)意義不明變異(VUS)的致病性判斷，需要依靠代謝組學(xué)測(cè)定明確對(duì)應(yīng)的代謝異常、酶活性測(cè)定判斷蛋白功能改變或檢測(cè)特異性生化標(biāo)志物。如膽汁酸合成障礙需要檢查膽汁酸譜，氨基酸、脂肪酸及有機(jī)酸代謝障礙需檢查血串聯(lián)質(zhì)譜及測(cè)定尿有機(jī)酸譜、溶酶體病、NGLY1缺陷病酶活性、糖基化障礙糖組學(xué)等。確診或排除遺傳性肝病需要在臨床表型、基因型、生化標(biāo)志物及功能研究方面有充分的依據(jù)。

三、肝病基因診斷面臨的挑戰(zhàn)及機(jī)遇

基因診斷數(shù)據(jù)量龐大，篩查并判斷眾多可疑致病突變與臨床表型的相關(guān)性需要較長時(shí)間及大量的功能驗(yàn)證工作。近期發(fā)現(xiàn)的眾多疾病相關(guān)基因仍缺乏針對(duì)性治療措施，明確分子機(jī)制后仍需要建立細(xì)胞模型及動(dòng)物模型以尋找有效藥物或其他干預(yù)措施。最終有效治療措施經(jīng)過人體試驗(yàn)驗(yàn)證并普及到所有受累患者需要大量的時(shí)間、人工及經(jīng)濟(jì)成本。

雖然基因診斷已成功應(yīng)用于單基因或雙基因肝病的診治，部分復(fù)雜或疑難肝病仍無法明確其分子機(jī)制，考慮可能為環(huán)境因素與多基因代謝通路相互作用所致。WGS的優(yōu)點(diǎn)在于覆蓋了整個(gè)基因組序列，標(biāo)本處理更加簡便、測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高、基因確診率更高。但WGS發(fā)現(xiàn)的變異更多，數(shù)據(jù)分析難度更大，有時(shí)無法辨別獨(dú)立致病的變異、參與致病的變異及決定療效的變異。雖然不是所有發(fā)現(xiàn)的變異均有臨床應(yīng)用價(jià)值，但隨著臨床表型及基因型數(shù)據(jù)庫的不斷完善，肝病個(gè)體化醫(yī)療很可能在不久的將來成為現(xiàn)實(shí)。