福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源的ISSR分析

趙依杰 林麗霞 姚立萍 駱志堅(jiān) 胡章瓊

摘要：研究利用ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)21份福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為福州地區(qū)柑橘的品種鑒定及育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。試驗(yàn)從27條ISSR引物中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的14條引物，對(duì)供試材料進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。獲得162條總條帶，其中多態(tài)性條帶129條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為79.63%;聚類結(jié)果顯示21份資源可分為5個(gè)組，13份福橘被聚為同一組，進(jìn)而可劃分為4個(gè)亞組。ISSR標(biāo)記能較好地區(qū)分福州地區(qū)柑橘資源，且福州柑橘地方資源遺傳多樣性豐富。

關(guān)鍵詞：柑橘;種質(zhì)資源;福州;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S666.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號(hào)：cjas18080021

0引言

柑橘（Citrus reticulata）是蕓香科屬植物[1]，喜溫暖濕潤(rùn)氣候。一般適合在12.5-37℃的溫度下生長(zhǎng)發(fā)育，也與日照、水分、土壤以及海拔等環(huán)境條件緊密相關(guān)。柑橘栽培歷史悠久，色彩絢麗的柑橘全身都是寶，不僅有很高的食用價(jià)值而且還具有藥用及保健功效[2-3]。不過(guò)，與其他果樹(shù)相比，柑橘易發(fā)生種間雜交及與其近緣枳屬、金柑屬之間的雜交，還受到芽變、環(huán)境及栽培方式等影響，以致發(fā)生了遺傳變異而擁有眾多遺傳資源[4]。福州位于歐亞大陸東南邊緣，東臨太平洋，是典型的亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均降水量900-2100mm，年平均氣溫16-20℃，海拔多在600-1000m之間。因此，氣溫適宜和雨水充足的福州適合柑橘的廣泛種植及新品種的培育。但是，福州地區(qū)柑橘品種鑒定及其研發(fā)利用仍處于滯后階段，研究其種質(zhì)資源遺傳多樣性對(duì)遺傳改良和優(yōu)異種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。目前，已有較多關(guān)于柑橘遺傳多樣性的研究報(bào)道，但鮮有針對(duì)福州地區(qū)柑橘資源的評(píng)價(jià)研究[5-7]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)福州地區(qū)的部分柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系評(píng)價(jià)，以期為福州地區(qū)柑橘種質(zhì)資源的創(chuàng)新、研發(fā)利用及保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

21份柑橘種質(zhì)資源采自福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所柑橘種質(zhì)資源圃（表1）。選取新生幼嫩、無(wú)病害葉片置于錫箔紙中，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)中所用試劑藥品均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。

1.2DNA的提取與純化

選取健康幼嫩的柑橘葉片，參考改良過(guò)的CTAB-mini法[8]提取葉片基因組DNA，測(cè)定其純度，用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度與純度質(zhì)量。最終將DNA稀釋到25ng/μL，于-20CC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ISSR反應(yīng)條件建立及引物篩選

通過(guò)對(duì)基因組DNA濃度、TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTP、退火溫度等主要因素的調(diào)整、優(yōu)化，確定ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20μL，PCR反應(yīng)液含有的組分和終濃度為：DNA模板1μL（20ng/μL），引物1μL（10μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 10μL，ddH2O8μL。

實(shí)驗(yàn)根據(jù)加拿大溫哥華哥倫比亞大學(xué)ISSR引物庫(kù)數(shù)據(jù)，查閱文獻(xiàn)選取27條引物，并委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。在引物篩選中，以隨機(jī)挑選的5個(gè)樣品的DNA為模版進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，最終挑選出14條引物。

1.4ISSR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，最適退火溫度下退火1min（退火溫度隨引物而定），72℃延伸1min，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：以Trans2K Plus DNA Mark為分子量標(biāo)記，在0.5xTBE緩沖液中，于2%瓊脂糖凝膠，90V電壓下電泳50min，用Britain GGM/D2凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)各居群ISSR-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行判讀，每個(gè)電泳圖譜中同一擴(kuò)增位點(diǎn)上有條帶記作“1”，無(wú)條帶記作“0”，得到由“1”和“0”組成的二元式數(shù)據(jù)矩陣[9]。運(yùn)用NTSYS-pc2.1Oe軟件的Dice方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，建立聚類分析樹(shù)狀圖[10]。

2結(jié)果與分析

2.1引物篩選

從27條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物，編號(hào)依次為Z810、Z825、Z807、Z834、Z840、Z855、Z873、Z809、Z826、Z842、Z847、Z848、Z867、Z881，用于21個(gè)樣本的遺傳多樣性分析。圖1為引物對(duì)柑橘15個(gè)樣本總DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增的瓊脂糖電泳圖譜。

2.2ISSR擴(kuò)增結(jié)果

篩選的14條引物共擴(kuò)增出清晰可重復(fù)的條帶162條，平均為11.57條，擴(kuò)增產(chǎn)物主要介于250-3000bp，擴(kuò)增條帶數(shù)最少和最多的引物分別是Z848、Z881，各擴(kuò)增出7條和17條條帶。其中多態(tài)條帶129條，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率占79.63%;多態(tài)性最低的引物是Z842，多態(tài)性為60%;多態(tài)性最高的引物是Z825，多態(tài)性高達(dá)100%。

2.3 21份福州地區(qū)柑橘的群體結(jié)構(gòu)分析（基于距離聚類）

采用NTSYSpc2.le軟件根據(jù)Nei's遺傳一致度，利用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA），對(duì)供試的21份柑橘個(gè)體進(jìn)行遺傳關(guān)系聚類，得到福州柑橘聚類樹(shù)狀圖（圖2）。如圖所示，當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.72為閡值，可將供試的21份材料劃分為5組（A、B、C、D、E）。A組包含5份資源，在組中‘日輝、‘紅皮桔相聚，‘魯賓諾、‘托馬特拉相聚，再與‘秋輝聚類，說(shuō)明‘日輝與‘紅皮桔親緣關(guān)系較近，‘魯賓諾與‘托馬特拉親緣關(guān)系較近。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，A組又可分為3個(gè)亞組，‘日輝與‘紅皮桔、‘魯賓諾與‘托馬特拉依然聚類為一組，而‘秋輝獨(dú)立一組，這說(shuō)明‘秋輝與‘魯賓諾、‘托馬特拉的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。B組包含13份資源，具體為‘閩清2號(hào)、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號(hào)、‘珠心胚1號(hào)、‘珠心胚2號(hào)、‘閩侯大義、‘江南橫槎、‘砂糖橘、‘蘆柑、‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔和‘日本桔，且這13份柑橘種質(zhì)資源都為福橘并存在一定的親緣關(guān)系。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.80為閾值，可將B組資源分成為4個(gè)亞組。B1‘閩清2號(hào)、‘閩清新1、‘東岱、‘閩清1號(hào)、‘珠心胚1號(hào)、‘珠心胚2號(hào)、‘閩侯大義、‘江南橫槎;B2‘砂糖橘、‘蘆柑;B3‘溫州蜜桔、‘新余蜜桔;B4‘日本桔。說(shuō)明亞組內(nèi)各資源可能存在相對(duì)密切的親緣關(guān)系。C組為‘黃果柑單獨(dú)成組，為柑類;D組為‘黑納蒂娜單獨(dú)成組，為雜柑類;E組為‘桔柚單獨(dú)成組，為桔柚類。

3結(jié)論與討論

在柑橘親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析方面，已采用RAPD、AFLP、SSR、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行研究[5-7.11-15]。王三紅等[16]應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)臍橙品系和葡萄柚品系進(jìn)行鑒別;謝讓金等[17]利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)真正柑橘果樹(shù)群6屬植物間以及柑橘屬各主要類型（種）的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的討論;辜青青等[18]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)28份南豐柑橘資源進(jìn)行基因組多態(tài)性分析，他們發(fā)現(xiàn)南豐廣橘品種群中‘蜜廣與南豐蜜橘品種群親緣關(guān)系較近，而‘紅廣與親本南豐蜜橘和‘紅橘的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn);施維屬等[19]運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)24份甜橙種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系相對(duì)較近，并找到了鑒定不同品種的特異性標(biāo)記。

ISSR既綜合了RFLP、RAPD及SSR等分子標(biāo)記技術(shù)的各種優(yōu)點(diǎn)，又具有較高的多態(tài)性和穩(wěn)定性，無(wú)需預(yù)知物種DNA信息背景，操作簡(jiǎn)單，成本低，廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究[11.20-22]。因此，本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，并通過(guò)篩選得到14對(duì)高效ISSR引物對(duì)21份樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到位點(diǎn)162個(gè)，多態(tài)率高達(dá)79.63%，多態(tài)性較高，表明供試柑橘基因組DNA具有明顯的遺傳差異，具有較高的遺傳多樣性。此次試驗(yàn)所選的21份柑橘種質(zhì)資源均采自福州地區(qū)，其中13份柑橘種質(zhì)資源為福橘，意在探究福橘與其他引進(jìn)品種之間的親緣關(guān)系，以便對(duì)地方特色柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行更好地保護(hù)和遺傳改良。因柑橘葉片中富含酚類、單寧及多糖等干擾物質(zhì)增加了基因組提取難度，施維屬等[8]采用液氮下研磨柑橘葉片進(jìn)行DNA提取。傳統(tǒng)的酚-氯仿提取操作繁瑣且有毒，而本研究所用的磁珠法核酸提取技術(shù)操作簡(jiǎn)單、毒性低且可多個(gè)樣品同時(shí)提取，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方式。

遺傳一致度是從相同的方向?qū)┰嚨母涕龠M(jìn)行遺傳關(guān)系方面的分析，親緣關(guān)系越近的柑橘遺傳一致度系數(shù)越接近[23-25]。根據(jù)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)所產(chǎn)生的“1”、“0”矩陣數(shù)據(jù)，并利用NTSYSpc2.1軟件根據(jù)Nei's遺傳一致度，利用UPGMA法對(duì)福州21份柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行聚類與分析，由圖2分析，供試柑橘之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.64-0.96。遺傳相似系數(shù)在0.64處，21份柑橘資源可以分成2類，即桔柚類和余下20份柑橘資源聚成1類。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.72為閾值可將供試的21份材料劃分為5組。聚類分析結(jié)果顯示同一類別的柑橘種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較近，往往劃分在同一組。本研究表明ISSR可有效揭示福州種質(zhì)資源的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳分化程度，為探討福州地區(qū)柑橘的適應(yīng)性和生存力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，能夠及時(shí)為瀕危品種制定科學(xué)有效的保護(hù)方案并采取相應(yīng)的措施。

4問(wèn)題與展望

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能有效地鑒定柑橘不同品種及分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，但所需引物需要具有更強(qiáng)的專一性，為此在篩選引物時(shí)增加了試驗(yàn)工作量;同時(shí)，需要一定時(shí)間摸索PCR擴(kuò)增的最適反應(yīng)條件;此外，ISSR分子標(biāo)記呈顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型[26]。在計(jì)算遺傳相似系數(shù)時(shí)可能存在無(wú)法避免的偏差，有些長(zhǎng)度剛好相等的條帶出現(xiàn)在同一個(gè)位置上，但并不一定來(lái)自基因組上的同一區(qū)域。因此，對(duì)柑橘分類的研究應(yīng)該考慮各方面的影響因素綜合分析。今后柑橘遺傳圖譜研究中，可利用ISSR標(biāo)記和其他分子標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合來(lái)共同構(gòu)建，并可利用與目標(biāo)質(zhì)量性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)量性狀選擇，如抗病性、抗蟲性和抗鹽性等。同時(shí)，充分利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行柑橘種質(zhì)資源的鑒定及新種質(zhì)的創(chuàng)新，還應(yīng)注重分子標(biāo)記與豐富的傳統(tǒng)育種經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合，提高柑橘在農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)

[1]Velasco R，Concetta L. A genealogy of the Citrus family[J]. NatBiotechnol， 2014（32）：640-642.

[2]趙霖，趙和.柑橘類水果的營(yíng)養(yǎng)與健康[J].現(xiàn)代閱讀，2018（4）：98-99.

[3]童紅梅.柑橘類橙皮素的藥用價(jià)值及應(yīng)用[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2011（9）：38-40.

[4]張敏，鄧秀新.柑橘芽變選種以及芽變性狀形成機(jī)理研究進(jìn)展[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006（6）：871-876.

[5]劉通，鄧崇嶺，程土芳，等.利用SSR和SRAP技術(shù)分析廣西柑橘種質(zhì)遺傳多樣性[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（2）：23-29.

[6]施維屬.福建相橘種質(zhì)資源ISSR分子評(píng)價(jià)[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

[7]郭麗英，黃桂香，何新華，等.扁柑種質(zhì)資源親緣關(guān)系的ISSR分析[J].熱帶作物報(bào)，2011（3）：443-446.

[8]施維屬，潘騰飛，鐘鳳林，等.柑橘基因組DNA快速提取及ISSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（10）： 109-113.

[9]周敏，高慧新，王孝勛，等.雞血藤ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（17）：54-56.

[10]林立，王志龍，付濤，等.39個(gè)櫻花品種親緣關(guān)系的ISSR分析[J].植物研究，2016，36（2）：297-304.

[11]黃綠紅，劉詠紅，李高陽(yáng)，等.ISSR標(biāo)記技術(shù)在湖南柑橘主要品種親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（17）：117-119，122.

[12]Laigou G A. Genetic relationships in cultivated tea clones andnative wild tea in Taiwan using RAPD and ISSR markers[J]. BotBull Acad Sin，2001.42：93-100.

[13]Sharaf A A，Abkenar A A. Sharafi A，et al.Genetic variationassessment of acid lime accessions collected from south of lranusing SSR and ISSR molecular markers[J]. Physiol Mol Biol Plants，2016.22（1）：87-95.

[14]Munankarmi N N，Rana N，Bhattarai T， et al Characterization ofthe Genetic Diversity of Acid Lime （Citrus aurannfolia （Christm.）Swingle） Cultivars of Eastem Nepal Using Inter-Simple Sequence Repeat Markers[J]. Plants.2018，7（2）：46.

[15]賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（4）：2-11.

[16]王三紅，陳力耕，章鎮(zhèn)，等.RAPD在柑橘品系鑒別上的應(yīng)用[J].果樹(shù)科學(xué)，2000（1）：70-72.

[17]謝讓金，周志欽，鄧烈.真正柑橘果樹(shù)類植物基于AFLP分子標(biāo)記的分類與進(jìn)化研究[J].植物分類學(xué)報(bào)，2008（5）：682-691.

[18]辜青青，曾濤，魏清江，等.基于SSR標(biāo)記技術(shù)的南豐柑橘種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2017，34（6）：653-659.

[19]施維屬，王江波，李開(kāi)拓，等.24份甜橙種質(zhì)資源的ISSR分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2010（6）：902-907.

[20]McGregor C E， Lambert C A， Greyling M M. et al. A comparativeassessment of DNA fingerprinting techniques （RAPD， ISSR， AFLPand SSR） in tetraploid potato （Solanum tuberosum L.） germplasm[J].Euphytica，2000，113（2）： 135-144.

[21]代惠萍，趙樺，賈根良，等.ISSR指紋圖譜分析鑒定油茶遺樣性的研究進(jìn)展[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（6）：88-91.

[22]宋曉兵，彭埃天，劉景梅，等.ISSR分子標(biāo)記及其在中國(guó)南方果樹(shù)上的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（7）：199-201.

[23]雷天剛，何永睿，彭愛(ài)紅，等.貴州部分柑橘地方品種遺傳背景的SSR分析[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)，2015（11）：30-35.

[24]王炯，龔桂芝，彭祝春，等.基于COSMarker分析柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬植物的遺傳與進(jìn)化[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（2）：320-331.

[25]劉冰浩，鄧崇嶺，陳傳武，等.廣西地方柑橘資源的ISSR分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2015，32（6）：1001-1006.

[26]張立榮，徐大慶，劉大群.SSR和ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（1）：90-94.

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目“福桔種質(zhì)資源的收集、保存、利用和創(chuàng)新”（2017N0060），“都市特色園藝作物種質(zhì)資源保護(hù)與創(chuàng)新利用”（2016N3018）。

第一作者簡(jiǎn)介：趙依杰，男，1970年出生，福建長(zhǎng)樂(lè)人，研究員，碩士，研究方向：瓜果品種選育與栽培生理。通信地址：350018福州市倉(cāng)山區(qū)城門石步275號(hào)福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：zyjie1970@163.com。

通訊作者：胡章瓊，女，1974年出生，湖北公安人，副研究員，研究方向：果樹(shù)栽培與育種。通信地址：350018福州市倉(cāng)山區(qū)城門石步275號(hào)福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，Tel：0591-83508677，E-mail：549392473@qq.com。

收稿日期：2018-08-23，修回日期：2019-02-26。