溫濕度對草莓炭疽菌侵染草莓葉片的影響

趙玳琳 何海永 楊學輝

摘要：為探索草莓炭疽病潛伏侵染條件提供理論依據(jù)。本研究在離體條件下通過調(diào)控室內(nèi)溫濕度對草莓炭疽病的發(fā)病情況及侵染特性差異性進行研究。結(jié)果表明：溫濕度組合處理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接種7天后均能發(fā)病，處理10℃/70%接種后28天才輕微發(fā)病。侵染特性差異性研究表明，處理25℃/85%，接種6h，25%的分生孢子開始萌發(fā);接種12h，附著孢開始形成，形成率為16%，接種48h，葉片開始出現(xiàn)零星病斑;接種7天，葉片組織細孢大量腐爛崩解，病指為39.07。處理10℃/70%，接種1天，2.88%分生孢子開始萌發(fā);直至接種24天，分生孢子萌發(fā)率達到100%，附著孢開始形成，形成率為8.83%;接種28天，葉片開始出現(xiàn)零星病斑，病指僅為1.85;接種42天，葉片組織大面積腐爛，形成典型的炭疽病斑。得出處理10℃/70%接近該病害發(fā)病的底線溫濕度條件，此條件下的潛伏期能夠達到28天。

關(guān)鍵詞：草莓;草莓炭疽病;溫濕度;附著孢;潛伏侵染;病情指數(shù)

中圖分類號：S4

文獻標志碼：A

論文編號：cjas19030005

0引言

草莓炭疽病是全世界草莓產(chǎn)區(qū)的重要病害，1931年Brooks首次報道了草莓炭疽病的發(fā)生[1]。草莓炭疽病是由半知菌亞門真菌糞科菌綱（Sordariomyeete）黑痣菌目（Phyllacholales）黑痣菌科（Phyllachoraceae）刺盤孢菌屬（Colletotrichum spp.）真菌侵染所致[2]，病原菌主要包括3種：草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）[1]、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[3]和尖孢炭疽菌（C.acutatum）[4]。

近年來，草莓炭疽病己成為繼灰霉病和白粉病之后制約中國草莓生產(chǎn)的第三大病害，能造成草莓減產(chǎn)25%-30%，嚴重時80%，影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-8]。因此，尋求新的病害防治策略、開發(fā)新的病害安全控制體系對該病害的防治顯得尤為迫切。

草莓炭疽病病菌是典型的高溫高濕型病菌，降雨量越大，田間濕度越高，炭疽病發(fā)病率越高，死苗率越高[9]，最適侵染氣溫為28-32℃、相對濕度在90%以上，在生產(chǎn)田前期的發(fā)病期為9-12月，進入1月（低溫）后病菌活動受抑制，病原菌常以菌絲體或分生孢子的形式越冬，停止發(fā)病，到4周下旬氣溫上升，當環(huán)境條件適宜時，病害病菌開始活動，病害繼續(xù)發(fā)生[10-11]。草莓炭疽菌大多具有潛伏侵染的特性，及帶菌種苗并不表現(xiàn)癥狀，待有利于病原活動的條件出現(xiàn)，病菌就開始生長和擴展，使草莓植株發(fā)病[12]。

目前，潛伏侵染的研究多偏重于對潛伏侵染的確定和組織病原學研究[13]，對導致其潛伏侵染的原因和延長潛伏期的方法研究也越來越受到重視，對于草莓炭疽病的潛伏侵染的確定及檢測草莓病原菌潛伏的方法主要是殺死植物組織，以促進潛伏侵染的真菌產(chǎn)孢達到檢測的目的，如利用除草劑paraquat（百草枯）[14]、酒精[15-17]、低溫冷凍法[18]、紫外線（uv）照射法[19]等殺死植物組織促使病原菌產(chǎn)孢。然而，目前對于草莓炭疽病潛伏侵染微環(huán)境條件研究還比較缺乏，草莓大田生產(chǎn)上一般用種苗繁殖，種苗上如果有潛伏侵染的存在，往往會引起病原菌的傳播，為生產(chǎn)帶來巨大的損失。因此，對草莓炭疽菌潛伏侵染的微環(huán)境條件進行研究，明確草莓炭疽病發(fā)生潛伏侵染的微環(huán)境，是避免草莓炭疽病危害的有效措施。本研究在室內(nèi)調(diào)控條件下通過對草莓炭疽病發(fā)病微環(huán)境以及發(fā)病嚴重條件和發(fā)病輕微條件侵染動態(tài)過程差異性進行觀察研究，以期為探索該病害潛伏侵染微環(huán)境條件提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗時間、地點

室內(nèi)試驗于2018年1-5月在貴州省植物保護研究所生防研究室進行。

1.2試驗材料

1.2.1供試菌株草莓炭疽病菌（C. fragariae）熒光菌株：LC0220-7GFP，由中國科學院微生物研究所饋贈，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2供試草莓品種‘黔莓2號，健康草莓葉片采集于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所溫室大棚，用滅菌剪刀剪取大小均勻、生長周期較一致的健康草莓葉片若干用滅菌水保濕備用。

1.2.3供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g、瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

1.3試驗方法

1.3.1病原菌分生孢子懸浮液制備 將在斜面保存的病原菌轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上，置于28℃光暗交替人工培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，用滅菌槍頭在長菌平板上加入適量無菌水，用滅菌玻璃棒輕輕刮取菌落表面菌絲，之后用4層過濾紙過濾，收集分生孢子懸浮液，在低倍顯微鏡下鏡檢，用血球計數(shù)板計數(shù)，通過離心濃縮或加入無菌水稀釋等方法計算配成濃度為106個/ml的分生孢子懸浮液，為提高分生孢子液在葉片上的粘著性，在接種前加入數(shù)滴0.1%Tween-20[20]。

1.3.2接種方法將備好的草莓葉片用無菌水洗凈，用75%酒精表面消毒，再用無菌水沖洗后整齊放置于鋪有濕潤吸水紙的塑料盆中，用無菌水濕潤后的濕棉花壓住葉柄，確保葉片能長時間保持新鮮，用滅菌槍頭吸取備好的濃度為1*106個/mL的分生孢子懸浮液（每葉片500μL）接種于草莓葉片上，以噴灑無菌水作為空白對照，接種好后置于不同溫濕度處理光暗交替人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3不同溫濕度處理對草莓炭疽菌侵染草莓葉片的影響根據(jù)草莓炭疽病的發(fā)病規(guī)律，及草莓炭疽病1月份病菌活動受抑制，停止發(fā)病，直至3-4月，氣溫上升，出現(xiàn)病狀[2-3]。本試驗根據(jù)3-4月（該病害開始出現(xiàn)癥狀）溫濕度條件對草莓炭疽病發(fā)病的微環(huán)境條件進行研究，溫度的調(diào)節(jié)梯度為10℃、15℃、20℃和25℃，濕度的調(diào)節(jié)梯度為70%、75%、80%和85%，將接種好的葉片分別置于7個溫濕度組合：溫度25℃/濕度85%、溫度10℃/濕度80%、溫度15℃/濕度80%、溫度20℃/濕度80%、溫度15℃/濕度75%、溫度10℃/濕度75%、溫度10℃/濕度70%在12h/12h光暗交替培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。每處理重復3次，每重復6片葉片。在接種不同時間點調(diào)查其發(fā)病狀況，調(diào)查時間點根據(jù)葉片發(fā)病情況而定，最后根據(jù)發(fā)病葉片分級標準計算其病情指數(shù)。

發(fā)病葉片分級標準：0級，無病;1級，葉片病斑面積20%以下;3級，葉片病斑面積在20%-40%之間;5級，葉片病斑面積在40%-60%之間;7級，葉片病斑面積在60%-80%之間;9級，葉片病斑面積80%以上。

病情指數(shù)計算，見公式（1）。

病情指數(shù)=∑（葉片發(fā)病各級級別×各級葉片數(shù)）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高分級級別*100…………（l）

1.3.4侵染特性差異性觀察通過不同溫濕度對草莓炭疽菌侵染草莓葉片的影響實驗選取發(fā)病較嚴重和發(fā)病緩慢（接種后長時間幾乎不發(fā)病）的2個處理，按照Sesma等[21]和Morocko-Bicevska等[22]的方法在接種不同時間點取樣，取樣時間點根據(jù)葉片發(fā)病情況而定，每個時間點隨機取樣3片葉片及3個處理，用滅菌刀片在葉片上從橫向和縱向切取5-10片薄片，制作成臨時水裝片，用于熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，觀察2個處理之間侵染特性的差異性。熒光顯微鏡設置：Diode/Argon/HeNel-HeNe2激發(fā)光，綠色應熒光通過488nm濾鏡觀察。

1.3.5統(tǒng)計分析采用DPS（7.05版本）軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并用最小顯著差異法（LSD）比較不同處理間的差異顯著性（p<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫濕度組合對草莓炭疽菌侵染草莓葉片的影響

由表1可知，在接種草莓炭疽菌后的5次調(diào)查中，處理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接種7天后均能發(fā)病，25℃/85%處理發(fā)病情況最嚴重，病指為39.07;處理10℃/75%在室內(nèi)接種后11天內(nèi)病害發(fā)展極為緩慢，接種11天時病指為8.25，直至接種后28天，病指才達到88.89;處理10℃/70%直至接種后28天才輕微發(fā)病，病指僅為1.85，說明室內(nèi)調(diào)控條件下，處理10℃/70%能使病原菌潛伏28天，處理10℃/70%接近草莓炭疽病發(fā)病的底線溫濕度條件。

2.2不同發(fā)病嚴重度處理之間侵染特性差異性研究

根據(jù)不同溫濕度組合條件對草莓炭疽菌侵染草莓葉片發(fā)病影響的試驗結(jié)果：選取發(fā)病嚴重的處理25℃/85%和發(fā)病接近底線溫濕度組合條件的處理10℃/70%做侵染動態(tài)過程差異觀察，研究兩者之間的侵染特性差異性。

結(jié)果得到：處理25℃/85%，接種6h，25%的分生孢子開始萌發(fā);接種12h，分生孢子萌發(fā)率能夠達到100%，附著孢開始形成，形成率為16%;接種24h，附著孢形成率達到70%（見表2）;接種2天，菌絲大量形成并沿著表皮細孢延伸成網(wǎng)絡狀，葉片開始出現(xiàn)零星病斑;接種6天，葉片組織細孢大量腐爛崩解（見圖1）。處理10℃/70%，接種1天后少數(shù)分生孢子開始萌發(fā)，萌發(fā)率僅為2.88%，之后分生孢子繼續(xù)緩慢萌發(fā);直至接種24天，分生孢子萌發(fā)率達到100%，分生孢子開始產(chǎn)生附著孢，附著孢形成率為8.83%;接種28天，附著孢形成率為73.33%（見表3），在寄主葉片上能用肉眼觀察到針頭狀病斑產(chǎn)生;接種42天，葉片組織大面積腐爛，形成典型的炭疽病斑（見圖1）。

在離體條件下，處理25℃/85%，接種1天后就能發(fā)病，處理10℃/70%，接種28天后才出現(xiàn)發(fā)病癥狀，處理10℃/70%接近該病害發(fā)病的底線溫濕度條件，此條件下的潛伏期能夠達到28天。

3結(jié)論與討論

通過對7個溫濕度組合對草莓炭疽病的發(fā)病情況進行研究結(jié)果得到，在室內(nèi)調(diào)控離體條件下，溫濕度組合處理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接種7天后均能發(fā)病，處理10℃/70%接種后28天才輕微發(fā)病。處理25℃/85%，接種6h，分生孢子開始萌發(fā)，接種12h，附著孢開始形成，接種2天，葉片開始出現(xiàn)零星病斑，接種6天，葉片組織細孢大量腐爛崩解形成典型炭疽病斑;處理10℃/70%，接種1天分生孢子開始萌發(fā)，接種24天，附著孢開始產(chǎn)生，接種28天，在寄主葉片上能觀察到針頭狀病斑，接種42天，葉片組織大面積腐爛，形成典型的炭疽病斑。

病原菌侵入植物組織以后，由于寄主或環(huán)境條件的限制，暫時停止生長活動，但仍保持其生命，寄主也不表現(xiàn)癥狀，這種現(xiàn)象即稱為潛伏侵染。潛伏侵染往往發(fā)生在不利于病原菌完成生活周期的植物生長期，待有利于病原活動的條件出現(xiàn)，潛伏的病原菌就開始生長和擴展使植物發(fā)病[23]。炭疽菌主要有3種潛伏侵染結(jié)構(gòu)：附著孢、侵染釘和菌絲[24]。馮淑芬1983年[25]報道，橡膠炭疽菌以附著孢作為潛伏結(jié)構(gòu)進行潛伏侵染，以保存菌的生存和侵染，不表現(xiàn)癥狀，當條件適合，附著孢則產(chǎn)生侵入絲侵入葉片組織內(nèi)部導致寄主1-3天后表現(xiàn)癥狀。本研究中在葉片出現(xiàn)癥狀的時候往往會出現(xiàn)大量附著孢，附著孢的出現(xiàn)也許是導致葉片發(fā)病的必要條件，如處理25℃/85%，接種24h，附著孢形成率達到70%，接種2天后葉片開始出現(xiàn)零星病斑，處理10℃/70%，接種28天，附著孢形成率為73.33%，此時已經(jīng)能在葉片上觀察到針頭狀病斑。因此，筆者認為，草莓炭疽病在潛伏侵染期間，其潛伏結(jié)構(gòu)主要是附著孢，此時的附著孢是一種潛伏結(jié)構(gòu)、抗逆結(jié)構(gòu)或存活結(jié)構(gòu)。

炭疽病發(fā)病與田間溫、濕度相關(guān)。馮淑芬1983年[25]報道，橡膠炭疽菌發(fā)展的理由首先是濕度，在進行離體接種或大田接種后不保濕培養(yǎng)葉片發(fā)病病情指數(shù)遠遠低于保濕培養(yǎng)，分生孢子在有一層水膜的情況下發(fā)芽最快，附著孢形成侵入絲的多少與空氣中的相對濕度呈正相關(guān)。因此，在生產(chǎn)上建議，提倡大棚避雨栽培，保持通風，深溝高畦，降低田間溫濕度，防止草莓炭疽病發(fā)生，以達到減少病害發(fā)生的目的。

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基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)科學院專項“貴州木霉菌資源收集、鑒定與多樣性分析”（黔農(nóng)科院院專項（2016）029號）;貴州省科研機構(gòu)服務企業(yè)行動計劃項目“貴州五種特色果蔬病蟲害綠色防控技術(shù)體系服務企業(yè)行動計劃”（黔科合服企（2015）4012）。

第一作者簡介：趙玳琳，女，1987出生，貴州安順人，助理研究員，碩士，主要從事植物真菌病害的生物防治研究工作。通信地址：550006貴州省貴陽市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn)貴州省農(nóng)業(yè)科學院，E-mail：dlsczhao@sina.com。

通訊作者：楊學輝，女，1966年出生，貴州遵義人，研究員，博士，主要從事植物病害防治研究工作。通信地址：550006貴州省貴陽市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn)貴州省農(nóng)業(yè)科學院，E-miail：yxuehui66@163.com。

收稿日期：2019-03-04，修回日期：2019-07-22。