生長(zhǎng)因子在半月板修復(fù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

游茗柯 羅俊容 付維力

四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科（成都610041）

1 前言

半月板是膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，發(fā)揮著重要作用，包括負(fù)載、傳遞、減震、穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)分配和本體感覺(jué)輸入等[1]。半月板常因運(yùn)動(dòng)損傷和年齡等因素發(fā)生變性而受損，并且因?yàn)閮?nèi)部血管化區(qū)域有限，導(dǎo)致其愈合能力相對(duì)較低。由于半月板損傷后自體再生能力較差，半月板切除術(shù)是目前最常見(jiàn)的治療方式。然而，切除后可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)不協(xié)調(diào)，并對(duì)相鄰的軟骨造成明顯的壓力，可能會(huì)導(dǎo)致軟骨過(guò)早的變性等[2]，半月板切除術(shù)的并發(fā)癥還可能最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthri?tis，OA）的發(fā)生[3]。因此，利用細(xì)胞生物學(xué)、生物材料科學(xué)和生物工程領(lǐng)域的先進(jìn)技術(shù)，結(jié)合干細(xì)胞、生物相容性支架和相關(guān)生長(zhǎng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)半月板纖維軟骨功能和穩(wěn)定性的再生十分重要[4]。

半月板再生所需要的條件包括：修復(fù)細(xì)胞、支架材料以及起生化刺激作用的生長(zhǎng)因子。迄今為止，在半月板組織工程中已經(jīng)檢測(cè)到各種細(xì)胞類(lèi)型，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial-derived mesenchy?mal stem cells，S-MSCs）、半月板纖維軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等[3]。支架材料可分為天然生物材料和人工合成材料，且兩種材料在半月板修復(fù)中均有重要應(yīng)用。在人工合成材料中，一類(lèi)為具有修復(fù)半月板撕裂的生物可降解組織膠粘劑，它們比縫合線更便宜，也更易使用，在愈合期間該材料可將組織的撕裂部分保持在一起，待愈合相對(duì)完全后會(huì)降解成無(wú)害的化合物，通過(guò)代謝等方式從體內(nèi)排出[5]。生長(zhǎng)因子通常被定義為：能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的天然物質(zhì)，是后生動(dòng)物細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子[6]。生長(zhǎng)因子最初被發(fā)現(xiàn)是由于它們能夠在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中激發(fā)靜止細(xì)胞的有絲分裂[7]。生長(zhǎng)因子的作用可概括為促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化、成熟等，并且其作用特點(diǎn)是在靶區(qū)快速擴(kuò)散和作用后快速失活。生長(zhǎng)因子是自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌機(jī)制的一部分，最常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[8]。

本研究檢索Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)、Ovid數(shù)據(jù)庫(kù)、ELSEVI?ER 數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索式為“（（（（（meniscus）OR menisci））AND（（（（（（Intercellular Signaling Peptides and Pro?teins）） OR Paracrine Peptide Factors） OR Peptide Factors，Paracrine） OR Paracrine Protein Factors）OR Growth Factors）） AND （（（（（（（（Stem Cells）OR Cell，Stem）OR Progenitor Cells）OR Cell，Pro?genitor） OR Mother Cells） OR Cell，Mother） OR Colony- Forming Unit） OR Colony- Forming Units））”。對(duì)檢索文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，有關(guān)半月板再生的細(xì)胞因子包括：胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1、TGF-β3）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ba?sic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、白細(xì)胞介素-1（interleukin，IL-1）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stro?mal-derived factor-1，SDF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepa?tocyte growth factor，HGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（con?nective tissue growth factor，CTGF）、骨成型蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、軟骨素酶-ABC（enzymatic chondroitinase-ABC）、粒細(xì)胞集中刺激因子（granulocyte concentration of stimulators，G-CSF），共14種。本文詳細(xì)介紹的與半月板再生有關(guān)的生長(zhǎng)因子主要有：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1、TGF-β3）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）。

2 常見(jiàn)生長(zhǎng)因子及其作用

表1 常見(jiàn)半月板再生相關(guān)生長(zhǎng)因子種類(lèi)及作用

2.1 IGF-1

生長(zhǎng)因子IGF-1 主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)GAG 和Ⅱ型膠原生成、增加蛋白多糖的合成速率來(lái)發(fā)揮作用[20]。

Bonnevie 等[25]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含IGF 的實(shí)驗(yàn)組GAG 含量遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)照組，且半月板表面初步形成包含局部纖連蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和潤(rùn)滑物質(zhì)的表面層物質(zhì)，而該種表面層潤(rùn)滑物質(zhì)由關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中潤(rùn)滑油素合成的增多所致，通過(guò)促進(jìn)邊界潤(rùn)滑，提高組織置換的效率，大幅提高潤(rùn)滑性能，從而減少組織間的磨損及惡化，有利于半月板組織的再生。

Fox[21]等在研究中發(fā)現(xiàn)，在IGF-1 與TGF-β1 的共同作用下，成纖維樣滑膜細(xì)胞表現(xiàn)出成纖維軟骨的巨大潛能，促進(jìn)Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖生成量顯著增加。該實(shí)驗(yàn)表明，這兩種生長(zhǎng)因子具有誘導(dǎo)軟骨形成的潛力。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibro?blast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）表達(dá)增加，生成了更多的α-平滑肌 肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），可能介導(dǎo)無(wú)血管區(qū)半月板的再生愈合。但在增加的Ⅱ型膠原中，細(xì)胞種子支架并沒(méi)有顯示出明顯的基質(zhì)的細(xì)化。

有實(shí)驗(yàn)顯示，IGF-1還具有刺激纖維軟骨細(xì)胞活性的能力，用以保持半月板所有區(qū)域（包括無(wú)血管區(qū)）細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的形成。其中，無(wú)血管區(qū)細(xì)胞對(duì)IGF-1的添加作出積極反應(yīng)[26，9]。而Ruiz[27]的實(shí)驗(yàn)則指出，IGF-1 是強(qiáng)有力的有絲分裂原，可促進(jìn)半月板膠原合成，IGF-1在血管區(qū)可發(fā)揮作用，但在無(wú)血管區(qū)無(wú)作用。

2.2 TGF-β

生長(zhǎng)因子TGF-β參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生命過(guò)程，包括細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、增殖、遷移、分化、凋亡以及合成和降解ECM、促進(jìn)無(wú)血管區(qū)GAG和Ⅱ型膠原蛋白的合成、促進(jìn)無(wú)血管區(qū)半月板的撕裂修復(fù)和工程材料在體內(nèi)的成熟和整合。

TGF-β的培養(yǎng)方式可分為單層培養(yǎng)、外植體培養(yǎng)或半月板細(xì)胞播種在支架上培養(yǎng)[22]。de Mulder 等將TGF-β接種于聚氨酯支架的山羊半月板纖維軟骨細(xì)胞上，通過(guò)觀察其生物學(xué)特性和力學(xué)性能的變化發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)于細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生都有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用[11]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可增加半月板細(xì)胞的增殖和積累，增強(qiáng)OA 軟骨細(xì)胞的軟骨形成，還確定TGF-β信號(hào)可控制耐藥突變預(yù)防濃度（mutation preventive concentration，MPC），從而導(dǎo)致Sox9基因的表達(dá)增加、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcrip?tion factor 2，RUNX 2）基因的表達(dá)降低[12]，使半月板綜合的修復(fù)能力得到進(jìn)一步提升[22]。

Spina 等將加入TGF-β1 與不加入TGF-β1 的培養(yǎng)基作對(duì)比[13]，發(fā)現(xiàn)含TGF-β1 的培養(yǎng)基中GAG 含量相較于無(wú)TGF-β1組顯著增加，并且ECM含量的增加速度也比不含TGF-β組更快。與此相似，Chen 等[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在眾多生長(zhǎng)因子中，TGF-β1 增加膠原蛋白和GAG 合成的能力最強(qiáng)，且合成物質(zhì)的量最多。TGF-β1 同時(shí)還顯著提高了α-SMA 半月板細(xì)胞的數(shù)量，而α-SMA在細(xì)胞收縮中起關(guān)鍵作用，對(duì)于半月板損傷后修復(fù)具有重大意義。

TGF-β3 的連續(xù)添加[2]可刺激基質(zhì)沉積，提高修復(fù)界面的基質(zhì)密度從而提高整合度，同時(shí)增加細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)半月板的修復(fù)再生，促進(jìn)半月板間修復(fù)性結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步形成。

研究發(fā)現(xiàn)[29]，應(yīng)用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）和轉(zhuǎn)化組織生長(zhǎng)因子β3（TGF-β3）誘導(dǎo)間充質(zhì)干/祖細(xì)胞（MSCs）的募集和逐步纖維軟骨分化，可顯著改善了半月板損傷的愈合。Tarafder 等采用聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic-co-gly?colic acid，PLGA）微球來(lái)控制TGF-β3 的釋放速率，發(fā)現(xiàn)高劑量（1000 ng/ml）的CTGF和緩慢（0.29± 0.1 ng/day）的TGF-β3 釋放應(yīng)用于半月板外植體模型對(duì)無(wú)血管區(qū)半月板的綜合愈合最為有效，可使半月板組織的膠原纖維排列、纖維軟骨基質(zhì)形成和機(jī)械性能均得到一定程度的改善[29]。短期釋放CTGF 可招募局部間充質(zhì)干細(xì)胞，與緩釋TGF-β3 形成纖維軟骨結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)中間纖維的纖維軟骨愈合[29]。

Szojka 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境和TGF-β3 協(xié)同可介導(dǎo)纖維軟骨細(xì)胞形成內(nèi)半月板樣基質(zhì)干/祖細(xì)胞募集治療半月板損傷。

Fox[21]的研究則認(rèn)為，TGF-β需要與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合用于半月板修復(fù)再生治療，并且指出，TGF-β參與的半月板修復(fù)治療的副作用包括滑膜纖維素增生、炎癥性白細(xì)胞增加以及刺激骨贅的形成等。

Spina 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[13]，單獨(dú)使用TGF‐β3 比單獨(dú)使用TGF‐β1可以更有效地利用骨髓來(lái)源的真皮多能干細(xì)胞（dermal muhipotent stem cells，dMSCs）來(lái)促進(jìn)透明軟骨的形成。Spina 等在7 天內(nèi)通過(guò)檢測(cè)含TGF‐β3 和TGF‐β1 的單層培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞GAG 含量較使用單一生長(zhǎng)因子作用時(shí)增加了2倍，雖然膠原產(chǎn)生更為廣泛，但并沒(méi)有使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生增多。而TGF-β1、IGF-1、FGF-2三種生長(zhǎng)因子兩兩組合或同時(shí)作用聯(lián)合培養(yǎng)，對(duì)透明軟骨的促進(jìn)作用又較TGF-β3單獨(dú)使用時(shí)更好。

Hidalgo Perea 等的實(shí)驗(yàn)表明，含有TGF-β和地塞米松（dexamethasone，Dex）的無(wú)血清培養(yǎng)基是間充質(zhì)干細(xì)胞種子支架實(shí)驗(yàn)中最有前景的組合形式。該實(shí)驗(yàn)將半月板組織和間充質(zhì)干細(xì)胞種子支架復(fù)合成缺損模型，結(jié)果顯示無(wú)血清TGF-β和Dex 培養(yǎng)基可促進(jìn)半月板組織蛋白多糖的生成，促進(jìn)半月板組織的整體修復(fù)[31]。

Nakagawa等的研究表明，采用3D打印的生長(zhǎng)因子聚己內(nèi)酯（poly-ε-caprolactone，PCL）聯(lián)合應(yīng)用CTGF和TGF-β3 可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向纖維軟骨細(xì)胞系分化[32]。

2.3 PDGF

PDGF作為原絲分裂細(xì)胞的有絲分裂原，對(duì)半月板組織及細(xì)胞具有趨化作用，在半月板組織愈合中起重要作用，可促進(jìn)細(xì)胞和原生組織的遷移[14]。PDGF-AB可吸引內(nèi)源性細(xì)胞，增強(qiáng)其移動(dòng)性和遷移能力，并且，在半月板已缺損時(shí)，PDGF-AB與膠原酶的釋放可增加支架界面和支架內(nèi)部的細(xì)胞密度，并與周?chē)M織融合，在短期內(nèi)增強(qiáng)細(xì)胞向傷口邊緣的移動(dòng)性，并在長(zhǎng)期造成更好的支架定植和組織修復(fù)效果[14]。同時(shí)，PDGFAB與膠原酶的依次釋放，可增加細(xì)胞的移動(dòng)和細(xì)胞遷移。該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，半月板細(xì)胞的遷移量隨細(xì)胞孔徑的減小而減少，在存在不同濃度PDGF-AB的趨化梯度時(shí)尤為明顯。而當(dāng)孔徑小于等于3 微米時(shí)，其細(xì)胞遷移不受孔隙大小和PDGF-AB濃度的影響。

PDGF 對(duì)軟骨細(xì)胞和祖細(xì)胞也具有很強(qiáng)的趨化活性，可增強(qiáng)半月板細(xì)胞的增殖和生物合成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[15]，PDGF可以通過(guò)與肝素的共價(jià)連接或靜電相互作用固定在支架上持續(xù)釋放，但在無(wú)血管區(qū)病變中，其活性及表達(dá)程度均降低。PDGF-BB 可招募其他缺陷區(qū)域細(xì)胞產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)胞間連接的趨化作用，促進(jìn)纖維軟骨基質(zhì)成分的合成。

與之前PDGF 表達(dá)增加促進(jìn)半月板組織趨化作用的結(jié)果相反，Ruiz Iban[27]對(duì)比有血管區(qū)與無(wú)血管區(qū)半月板組織生長(zhǎng)因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PDGF-B 表達(dá)水平明顯下降，這可能與其對(duì)之前的TGF、IGF 等生長(zhǎng)因子發(fā)揮的促進(jìn)作用進(jìn)行干擾有關(guān)。

Su 等利用內(nèi)側(cè)半月板損傷的骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨下骨/骨髓中的單核前骨細(xì)胞在內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)后很早就受到刺激，并產(chǎn)生大量的PDGF-BB，從而激活PDGF-β受體信號(hào)，以刺激骨關(guān)節(jié)炎的異常發(fā)育軟骨下骨血管生成與成骨和神經(jīng)生長(zhǎng)的耦合，而血管侵入無(wú)血管軟骨，是人類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷特征[33]。

2.4 FGF

FGF-21是一種由肝臟、脂肪組織和血細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪因子/內(nèi)分泌激素，具有抗炎和抗衰老的特性。FGF-21 與關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，F(xiàn)GF-21 通過(guò)減少一些促炎細(xì)胞因子，可減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。

FGF 的功能可基本概括為促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)體內(nèi)半月板的修復(fù)，且作用與具有有絲分裂活性的生長(zhǎng)因子作用一致。有研究[16]采用生化、免疫組化、組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)等分析方法，觀察使用FGF治療骨關(guān)節(jié)炎，對(duì)細(xì)胞增殖和存活、細(xì)胞外基質(zhì)合成及α-SMA 收縮標(biāo)志物表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)FGF-2 尤其在愈合能力較差的區(qū)域和損傷部位的活性更高，其通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖率和存活率，使得治療后半月板的撕裂幅度下降，α-SMA 的表達(dá)水平上升有助于半月板的再生修復(fù)。Liang[22]的實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)GF-2 過(guò)度表達(dá)可刺激半月板纖維軟骨細(xì)胞在體外大量增殖，且促進(jìn)糖胺多糖在體外的合成，但不能促進(jìn)黏多糖的合成。FGF-2 與TGF-β1 結(jié)合共同作用可促進(jìn)骨膜細(xì)胞和人工關(guān)節(jié)軟骨形成細(xì)胞的擴(kuò)散比率進(jìn)一步增加。同時(shí)，Liang等還發(fā)現(xiàn)，在缺氧（5% O2）的情況下，可通過(guò)使用FGF-2，提高肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（myofibroblastic-like cell，MFLC）和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖率，進(jìn)而提高軟骨的分化能力。同時(shí)，上調(diào)MFLC 可促進(jìn)膠原蛋白Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表達(dá)。

而在對(duì)FGF的研究中，觀察FGF-2與明膠水凝膠（gelatin hydrogels，GHs）結(jié)合后的作用也較為常用。生長(zhǎng)因子通過(guò)與明膠分子的物理化學(xué)相互作用在明膠水凝膠中被固定化，水凝膠降解釋放出固定化的生長(zhǎng)因子，通過(guò)改變其交聯(lián)的程度，可控制水凝膠的降解程度，即交聯(lián)可以產(chǎn)生不同含水量的水凝膠，進(jìn)而控制釋放的固定化生長(zhǎng)因子的速度和含量。GHs與FGF-2結(jié)合后具有更高的生物穩(wěn)定性，能顯著促進(jìn)半月板細(xì)胞增殖，抑制半月板細(xì)胞死亡。Narita[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2與GHs結(jié)合后，其誘導(dǎo)生物力學(xué)強(qiáng)度增加、表層增厚、細(xì)胞增殖速度增加。Narita[18]在家兔實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合后FGF-2顯著增加了兔模型中半月板細(xì)胞的密度，并增強(qiáng)其修復(fù)能力。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證明FGF-2 為一種促生長(zhǎng)因子而并非抗生長(zhǎng)因子。

2.5 其他生長(zhǎng)因子及其作用

2.5.1 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）

Hidaka[34]利用腺病毒載體介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-HGF）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)組織工程半月板血管形成。用Ad-HGF 處理牛半月板細(xì)胞，將細(xì)胞接種于聚乙醇酸支架上，植入裸鼠皮下脂肪中，結(jié)果顯示，移植后2 周，Ad-HGF 處理的半月板細(xì)胞形成高于對(duì)照組，提示HGF 基因在生物工程半月板組織中參與到局部組織血液供應(yīng)的可能性。

2.5.2 IL-1

白細(xì)胞介素1β（IL-1β）是損傷關(guān)節(jié)局部炎癥的主要介質(zhì)。Chowdhury 等在實(shí)驗(yàn)中，將半月板細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理后共培養(yǎng)，檢測(cè)到培養(yǎng)顆粒中Sox9 基因、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的表達(dá)明顯高于未經(jīng)IL-1β處理的純培養(yǎng)組。與骨髓基質(zhì)細(xì)胞（marrow stroma cells，MSCs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的單次培養(yǎng)相比，在MSCs 和BMSCs 協(xié)同培養(yǎng)軟骨基質(zhì)中，IL-1β不能消除共培養(yǎng)中積累的GAG 基質(zhì)，但可介導(dǎo)聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Ⅱ型膠原和Sox 9基因表達(dá)，并使相關(guān)表達(dá)活性降低[19]。

有研究顯示，與對(duì)照組相比，IL-1β刺激半月板外植體可導(dǎo)致一氧化氮、基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生和活性以及相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生顯著增加[35]。

2.5.3 軟骨素酶-ABC

用軟骨素酶-ABC 和TGF-β1 處理半月板細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，與未進(jìn)行TGF--β1處理的對(duì)照組比較，軟骨素酶-ABC 和TGF-β1的聯(lián)合處理使膠原含量、膠原密度和纖維直徑明顯增加，協(xié)同提高纖維軟骨的楊氏模量和極限拉伸強(qiáng)度，形成了更致密的膠原基質(zhì)，從而能夠更好地承受拉伸載荷[36]。實(shí)驗(yàn)證明，軟骨素酶- ABC治療可能是通過(guò)交聯(lián)增加膠原蛋白與膠原蛋白之間的相互作用完成的[37]。

MacBarb 等將不同的半月板細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)接種到瓊脂糖孔中，分別用軟骨素酶-ABC和合成代謝劑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，應(yīng)用軟骨素酶-ABC 和TGF-β1可使膠原含量增加。膠原密度和纖維直徑也顯著增加，分別比對(duì)照組增加32%和15%。力學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組處理后可提高工程化纖維軟骨的楊氏模量和極限拉伸強(qiáng)度?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明軟骨素酶-ABC 和TGF-β1相互作用，形成更致密的膠原基質(zhì)，從而能夠更好地承受拉伸負(fù)荷[38]。

2.5.4 內(nèi)皮抑素

有研究結(jié)果顯示[23]，抗血管生成因子——內(nèi)皮抑素在纖維軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中的表達(dá)增加，表明該生長(zhǎng)因子可能限制半月板損傷后體內(nèi)組織的再生能力。

Hoberg 等將內(nèi)皮細(xì)胞與纖維軟骨細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)后，纖維軟骨細(xì)胞表達(dá)的抗血管生成因子內(nèi)皮抑素的產(chǎn)量增加，對(duì)VEGF 信號(hào)通路有抑制作用，導(dǎo)致了在共培養(yǎng)中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖顯著降低，由于傷口愈合需要足夠的生理性血管生成，所以內(nèi)皮抑素在軟骨細(xì)胞中表達(dá)的增加可能是導(dǎo)致半月板血管分布較少區(qū)域愈合能力差的原因之一[23]。

2.5.5 多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合培養(yǎng)

以動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的一項(xiàng)研究[26]顯示，PDGF-AB、PDGF-BB、TGF-β1和IGF-1在組織工程研究中的綜合運(yùn)用可能有助于促進(jìn)半月板細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖和分化。Tsujii等[26]在實(shí)驗(yàn)中探討生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)綿羊半月板軟骨細(xì)胞的增殖以及對(duì)聚羥基乙酸（polyglycol?ic acid，PGA）支架內(nèi)生長(zhǎng)的半月板軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)在含血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）-AB、PDGF-BB、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-I、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BFGF）的半月板軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，而IGF-Ⅱ和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對(duì)半月板軟骨細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。隨后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，引起最大增殖反應(yīng)的生長(zhǎng)因子（PDGF-AB、PDGF-BB、TGF-β1和IGF-I）對(duì)PGA支架內(nèi)OMC增殖和分化具有促進(jìn)作用，并且所有生長(zhǎng)因子均增加了半月板軟骨細(xì)胞在支架內(nèi)Ⅰ型膠原的生成量。該實(shí)驗(yàn)提示PDGFAB、PDGF-BB、TGF-β1和IGF-1的共同作用在半月板組織工程研究中可能有助于促進(jìn)半月板細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖和分化。

在以人體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究中，已知IGF-1、TGFβ1和bFGF 分別對(duì)人胎兒半月板細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，而于體外培養(yǎng)人胎兒半月板纖維軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，bFGF 和IGF-1、IGF-1 和TGF-β1 的組合對(duì)胎兒半月板細(xì)胞的增殖作用均優(yōu)于單一生長(zhǎng)因子，提示此組合可用于半月板種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增[36]。

而在成人半月板撕裂后無(wú)血管區(qū)的恢復(fù)重建中，Tarafder 等發(fā)現(xiàn)控制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和TGF-β3的含量，可以誘導(dǎo)無(wú)血管區(qū)半月板撕裂的無(wú)縫愈合以及進(jìn)一步誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的分化[39]。

3 總結(jié)

生長(zhǎng)因子與細(xì)胞之間的作用主要包括：通過(guò)促進(jìn)GAG、Ⅱ型膠原的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖；提高α-SMA半月板細(xì)胞數(shù)量，從而加速半月板再生；吸引內(nèi)源性細(xì)胞，提高細(xì)胞的移動(dòng)性和遷移能力等。且有研究發(fā)現(xiàn)[15]，促進(jìn)半月板損傷修復(fù)的細(xì)胞多存在于與撕裂部分鄰近的半月板區(qū)域、滑膜、關(guān)節(jié)囊內(nèi)。通過(guò)化學(xué)趨化因子的作用，如肝素，進(jìn)行細(xì)胞募集，用于介導(dǎo)半月板撕裂后修復(fù)再生的能力。這些均有利于半月板損傷后的再生與修復(fù)，對(duì)組織工程半月板再生起到積極作用。

生長(zhǎng)因子與支架材料之間的關(guān)系，除了需要支架材料作為承載區(qū)域限制生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用的范圍，從而更有利于支架材料與原有組織相融合，提高修復(fù)速率外，部分支架材料還可與生長(zhǎng)因子共同作用，增加反應(yīng)的可行性，如生長(zhǎng)因子與明膠水凝膠共同作用，可使該支架的生物力學(xué)強(qiáng)度增加，細(xì)胞增殖速度增加，更有利于損傷后的再生與修復(fù)工作。

生長(zhǎng)因子作用于靶細(xì)胞的方式包括：粘附在特定的受體上，受體通過(guò)信號(hào)或信使系統(tǒng)觸發(fā)并激活決定細(xì)胞增殖、分化和死亡的核基因[40]，并在短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)信號(hào)通路，產(chǎn)生合適的細(xì)胞外基質(zhì)成分：I型膠原、Ⅱ型膠原和聚集蛋白等[21]，進(jìn)而發(fā)揮生長(zhǎng)因子各項(xiàng)不同的功能及作用。

此外，我們還總結(jié)了生長(zhǎng)因子的有無(wú)、含量變化、單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng)的不同影響。如有研究使用成人滑膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在三維PGA 支架上培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在TGF- 1 和IGF-I 聯(lián)合作用下，出現(xiàn)明顯的軟骨形成增強(qiáng)，表明成人滑膜可能是軟骨工程應(yīng)用中一個(gè)有前途的自體細(xì)胞來(lái)源[24]。

臨床應(yīng)用方面，半月板損傷的常見(jiàn)治療方法包括同種異體移植、半月板切除等[41]，在半月板再生方面的作用十分有限。目前很有希望的方法是基于支架的組織工程半月板。在近年的半月板損傷修復(fù)研究中，有實(shí)驗(yàn)[42]設(shè)計(jì)了一種新的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅰ型（BM?PRI）模擬肽CK2.1，且發(fā)現(xiàn)在含透明質(zhì)酸的水凝膠顆粒中緩慢釋放水凝膠-模擬肽，該種模擬肽可在不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大的情況下驅(qū)動(dòng)軟骨修復(fù)。且注射該模擬肽可增加Ⅸ型膠原和Ⅱ型膠原的產(chǎn)量，并對(duì)ECM 成分具有明顯的修復(fù)作用?；加泄顷P(guān)節(jié)炎的患者其膠原骨架結(jié)構(gòu)和機(jī)械完整性遭到破壞，而水凝膠-模擬肽的不斷釋放在促進(jìn)受損軟骨再生的同時(shí)，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療也具有積極意義。該項(xiàng)研究表明，水凝膠-模擬肽顆粒不僅可以在不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大的情況下促進(jìn)軟骨再生，也可以作為退行性軟骨疾?。ㄈ绻顷P(guān)節(jié)炎）的潛在治療手段。

下一步要探討半月板損傷的更精確有效的修復(fù)方法[26]，為未來(lái)半月板損傷后的修復(fù)治療提供技術(shù)支持和臨床幫助。比如有研究顯示[43]，生長(zhǎng)因子在體內(nèi)無(wú)血管區(qū)半月板愈合方面并沒(méi)有明顯的改善情況，而其原因可能是體內(nèi)生長(zhǎng)因子的釋放失控。因此，進(jìn)一步研究的一個(gè)方向可能就是分析間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性物質(zhì)的有效分泌模式，為生長(zhǎng)因子在半月板缺損部位的特定應(yīng)用開(kāi)發(fā)出有效釋放模式。

最后，半月板損傷及其修復(fù)的未來(lái)研究還應(yīng)關(guān)注：首先，目前生長(zhǎng)因子在半月板修復(fù)中的應(yīng)用是否直接適用于所有的臨床情況。第二，對(duì)于生長(zhǎng)因子作用于半月板組織的實(shí)驗(yàn)研究所選擇的評(píng)估方式是否精確可靠。