沖擊波對大鼠骨骼肌鈍挫傷修復及IGF-1/PI3K/AKT信號通路的影響

呂欣 曹宇 周達岸

錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院（遼寧錦州121000）

骨骼肌鈍挫傷是體育鍛煉中的常見損傷，多發(fā)于腓腸肌和股四頭肌[1]。損傷處局部肌肉的收縮性能較損傷前會有所降低，并且周圍肌肉再次損傷的概率也會增加。損傷初期組織周圍水腫、炎性細胞浸潤、肌纖維排列紊亂；當進展到修復期時，出現(xiàn)新生肌纖維和血管，早期瘢痕形成；到重塑期時，新生肌纖維粘附在細胞外基質(zhì)，出現(xiàn)大量瘢痕[2-5]。骨骼肌損傷修復的病理進程離不開相關(guān)基因、蛋白及生長因子等的調(diào)控，它們的啟動和傳導又需要信號通路的激活。其中，IGF-1/PI3K/AKT 信號通路是重要途徑之一。胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是其重要調(diào)節(jié)起始點，磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB，即AKT）能夠被IGF-1 激活，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及蛋白合成等生理過程[6，7]。已有研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，PI3K/AKT 信號通路與骨骼肌的修復再生密切相關(guān)，不僅能夠促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成，而且還能刺激更多肌衛(wèi)星細胞（muscle satellite cells，MSCs）處于增殖狀態(tài)，再生新的肌細胞，進而達到促進骨骼肌再生、修復損傷的作用。目前，以沖擊波作為干預手段，通過該信號通路探討骨骼肌損傷修復作用的相關(guān)研究較少。本研究以沖擊波為干預措施，研究成肌分化抗原（myogenic differ?entiation antigen，Myod）、肌肉生長抑制素（Myostatin）和肌細胞生成素（Myogenin）在骨骼肌鈍挫傷修復時的表達變化及沖擊波對IGF-1/PI3K/AKT 通路的調(diào)控，探討沖擊波對骨骼肌鈍挫傷的作用效果和可能治療機制，為臨床治療及科學研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和分組

由錦州醫(yī)科大學SPF（specific pathogen free）級實驗動物中心購入21 只健康成年雄性SD（Sprague Daw?ley）大鼠，8～9 周齡，體重180 g ～200 g，飼養(yǎng)溫度控制在20℃～25℃，相對濕度50%～60%，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2017-0003，整個實驗操作過程符合倫理標準。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法將21只大鼠分為正常組、模型組和治療組，每組6 只，其中隨機選取3只大鼠檢驗造模是否成功。

1.1.2 主要試劑及儀器

Myod1 一抗、Myogenin 一抗（美國，abcam）、Myo?statin 一抗（武漢，三鷹），IGF-1 一抗、PI3K（p85）一抗、AKT 一抗、p-AKTSer473 一抗（南京，Biogot），GAPDH（北京，博奧龍），山羊抗兔二抗（美國，Earthox），West?ern blot 相關(guān)試劑（上海，碧云天），電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國，BIO RAD 公司），凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（美國，BIO RAD公司），免疫組化相關(guān)試劑（北京，索萊寶），體外沖擊波治療儀（瑞士，EMS公司），自制鈍挫傷重物打擊造模裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法

依照Markert等[11]的造模方式，自行設(shè)計鈍挫傷重物打擊造模裝置。打擊物重260 g，下落高度90 cm，重力為2.55 N，動能為2.29 J，打擊頭面積約1 cm2。大鼠雙側(cè)小腿后側(cè)毛在造模前12 h 用電動剃毛刀剃除，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液，根據(jù)大鼠體重麻醉（0.2 ml/100 g），俯臥位固定于鼠板上，雙后肢置于伸膝位、踝背屈90°，并且呈稍外展位固定，暴露腓腸肌中段，用紗布墊將后肢墊起，避免后肢懸空造模時發(fā)生骨折。

造模成功標準：鈍挫傷局部皮膚無開放性破損，腓腸肌腫脹，脛腓骨無骨折，無反?；顒樱ㄈ鐖D1），造模后大鼠可行走，呈輕微跛行步態(tài)。

造模后12 h隨機選取3只大鼠進行HE染色，光鏡下可見肌細胞破碎，排列不規(guī)則，炎癥細胞浸潤等肌纖維損害標志。

圖1 骨骼肌鈍挫傷造模后模型組腓腸肌（右圖為正常組與模型組對照）

1.2.2 干預措施及取材

正常組大鼠不作任何處理；模型組大鼠造模后不進行沖擊波治療；治療組大鼠于造模后24 h采用沖擊波刺激，作用于大鼠腓腸肌中段。設(shè)定參數(shù)：能流密度0.14 mJ/mm2，頻率10 Hz，沖擊次數(shù)500次，間隔3 d再次治療，于第2次治療后即刻對各組的6只大鼠進行取材檢測。2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，取各組腓腸肌，每組中的3只大鼠取材后的腓腸肌置于4%多聚甲醛溶液中固定18～24h，再放入30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片，進行HE 染色和免疫組織化學（immunohistochemis?try，IHC）檢測；每組中另外3只大鼠的腓腸肌組織于?80 ℃冰箱儲存，用于免疫印跡（Western blotting，WB）檢測。

1.2.3 HE染色方法

腓腸肌組織冰凍切片，橫切8 μm，依次將切片置于蘇木精染色液3 min，分化液30 s，自來水15 min，伊紅染色液1 min，然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在20×光學顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.4 免疫組化方法

冰凍切片橫切，PBS 沖洗，擦掉周圍液體，用組化筆圈出樣品；滴加0.3%甲醇雙氧水，避光30 min；PBS洗；山羊血清室溫封閉1 h，滴加稀釋的Myostatin 一抗50 μL（3% BSA-PBS 稀釋，1︰200），4℃過夜；PBS 沖洗；滴加二抗（1︰3000 稀釋），室溫孵育1 h，PBS 洗，5分鐘×3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察染色程度，待細胞著色，背底顏色淺時吸去，PBS 洗10 min；復染，分化，梯度酒精脫水，透明，封片。應(yīng)用Image Pro Plus 分析Myostatin的陽性表達。

1.2.5 免疫印跡法

取各組標本100 mg，于PBS溶液中剪碎，加入適量蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑后勻漿，4 ℃，12000 r/min，離心30 min，取上清液，蛋白定量，100℃煮沸。SDSPAGE電泳，90 V 30 min，110 V 90 min，至溴酚藍電泳至底部時終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜，300 mA 90 min，7%脫脂奶粉置于室溫2 h，TBST 洗膜后分別放入Myod1（1︰1000）、Myostatin（1︰1000）、Myogenin（1︰500）、IGF-1（1︰1000）、PI3K（p85）（1︰500）、AKT（1︰500）、p-AKTSer473（1︰500）、GAPDH（1︰3000）一抗稀釋液中4 ℃搖床孵育過夜；TBST 洗膜，二抗（1︰10000 稀釋）室溫1 h；洗膜，顯影，成像。Image J軟件分析各個目的蛋白的條帶灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

SPSS 24.0 軟件對不同組別數(shù)據(jù)進行分析，以均數(shù)± 標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和LSD 檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

大鼠造模后，鈍挫傷局部即腓腸肌中段腫脹，皮膚無開放性破損，脛腓骨無骨折，無反?；顒?，輕微跛行步態(tài)。

2.2 HE染色結(jié)果

正常腓腸肌組織橫切面肌細胞排列整齊，胞漿呈均勻粉紅色，細胞核呈藍色，少量且均勻分布于肌細胞邊緣（如圖2A）；模型組較正常組可見細胞排列間隙增寬，肌衛(wèi)星細胞遷移至細胞質(zhì)或損傷處周圍，出現(xiàn)肌絲及新生的單核或多核肌小管（如圖2B）；治療組較模型組相比，肌衛(wèi)星細胞多數(shù)均勻遷至細胞邊緣，間隙變小，并且多核肌小管增多（如圖2C）。

圖2 3組腓腸肌組織形態(tài)（HE染色，×200，標尺=50 μm）

2.3 免疫組化結(jié)果

Myostatin 在細胞質(zhì)中散在表達，正常組表達較少（如圖3A，表1）。模型組出現(xiàn)分布不均勻的棕黃色陽性表達，與正常組相比表達顯著升高（如圖3B，表1）（P<0.01）。給予沖擊波干預后，治療組Myostatin 的陽性表達減弱，與正常組相比無顯著性差異（P>0.05）；與模型組相比，治療組Myostatin 表達顯著降低（如圖3C，表1）（P<0.05）。

圖3 3組腓腸肌Myostatin表達情況（免疫組化，×200，標尺=50 μm）

表1 各組大鼠Myostatin表達量比較（n=3）

2.4 各組大鼠IGF-1/PI3K/AKT 信號通路及成肌相關(guān)因子的蛋白表達

由圖4和表2可知：與正常組相比，模型組和治療組PI3K、p-AKT 和AKT 的蛋白表達均升高（P<0.05），IGF-1 蛋白表達量明顯增加（P<0.01）；與模型組相比，治療組IGF-1 和p-AKT 的蛋白表達升高（P<0.01），PI3K 和AKT 的蛋白表達與模型組相比差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖4 各組大鼠檢測指標免疫印跡圖

由圖4和表3可知：與正常組相比，模型組Myo?genin 蛋白表達量增加（P<0.05），Myostatin 蛋白表達明顯增加（P<0.01），Myod1 蛋白表達雖然增加，但不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；治療組Myod1 和Myogenin 與正常組相比蛋白表達增加（P<0.01），Myostatin 相比于正常腓腸肌表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組相比，治療組Myod1 蛋白表達增加（P<0.01），Myogenin蛋白表達增加（P<0.05），Myostatin 蛋白表達下降（P<0.05）。

表3 各組大鼠Myod1、Myostatin和Myogenin蛋白表達量比較

3 討論

骨骼肌鈍挫傷是較為常見的運動損傷之一，是由突發(fā)的強大沖擊力所導致的閉合性肌肉損傷。鈍挫傷后腓腸肌血腫并且出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，損傷修復過程主要依靠激活更多肌衛(wèi)星細胞，促進成肌相關(guān)指標的表達，形成新生的單核或多核肌小管，逐漸融合成新的肌纖維[12]。以往研究表明，IGF-1/PI3K/AKT 信號通路的激活在促進成肌相關(guān)指標表達方面起著至關(guān)重要的作用，通過PI3K 蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)后磷酸化AKT，調(diào)控肌衛(wèi)星細胞增殖與分化[9，13]。

本次實驗應(yīng)用的沖擊波干預強度經(jīng)過前期實驗篩選[14，15]，最終確定為0.14 mJ/mm2、10 Hz、沖擊次數(shù)500次。沖擊波通過其具有力學性質(zhì)的高頻高速振動而產(chǎn)生的機械波作用于受損局部肌肉，通過力-化學信號的刺激，增加組織密度，促進肌衛(wèi)星細胞增殖與分化，最終使治療靶點內(nèi)損傷腓腸肌組織再生，修復損傷[16-18]。HE染色結(jié)果顯示，沖擊波治療后原本遷至細胞質(zhì)和損傷周圍的肌衛(wèi)星細胞逐漸均勻散布在細胞邊緣，并且多核肌小管增多，說明沖擊波治療對骨骼肌損傷的修復再生具有一定程度的促進作用。Myostatin是骨骼肌再生的負性影響因子，其表達減少能促進骨骼肌再生[19]，并且有研究表明Myostatin與IGF-1呈負相關(guān)性表達[8]。免疫組化和Western bloting 結(jié)果顯示，模型組與治療組的Myostatin 蛋白表達均高于正常組，且治療組表達低于模型組，說明沖擊波治療能夠抑制腓腸肌鈍挫傷后的Myostatin 蛋白表達。有研究[20]顯示，高頻振動能夠下調(diào)廢用性肌萎縮時Myostatin 的蛋白表達，促進肌萎縮的修復，這與本研究結(jié)果一致，并且沖擊波使IGF-1蛋白表達增加，可能通過直接和間接的雙重影響作用，降低Myostatin蛋白表達量。

當鈍挫傷發(fā)生后，肌衛(wèi)星細胞的增殖分化狀態(tài)被激活。Myod1 是肌細胞增殖標志物，本研究結(jié)果提示Myod1 正常組和模型組差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于取材時Myod1表達已處于升高后的下降水平。以往研究表明，Myod1在骨骼肌損傷進展過程中，在損傷后第1天或第3天表達量達到最高，第5天時下降至與正常組相比無統(tǒng)計學意義，與本研究結(jié)果一致[21，22]。沖擊波治療后Myod1 蛋白表達明顯高于正常組和模型組，這與Zissler 等[23]研究結(jié)果一致，可能是沖擊波高頻的機械振動促使其表達增加。劉宇等[21]研究表明，Myod1在小鼠骨骼肌損傷后第14天達到第2個表達高峰，因此，也有可能是沖擊波治療使Myod1 第2 個表達高峰提前。Myogenin是標志肌衛(wèi)星細胞分化的指標之一，骨骼肌損傷3～5天時，肌衛(wèi)星細胞開始融合成肌小管[21，22，24]。本研究中模型組表達增加，且HE染色顯示出現(xiàn)肌小管，治療組Myogenin表達量較模型組增加，多核肌管增多，可以推斷沖擊波在肌衛(wèi)星細胞分化方面具有一定影響作用，一定程度促進了肌衛(wèi)星細胞融合成肌管的過程。

本研究結(jié)果表明，沖擊波治療不能提高骨骼肌鈍挫傷后PI3K和AKT的表達，但可提高腓腸肌鈍挫傷后IGF-1 和p-AKT（Ser473）的水平，激活肌細胞內(nèi)的IGF-1/PI3K/AKT 信號通路，且有研究表明沖擊波對該信號通路具有一定調(diào)控作用[25]。IGF-1 是肌纖維形成的早期啟動子，能增強成肌細胞的增殖，也是激活PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵起始因子[9，26]。在正常生理狀態(tài)下，PI3K在細胞內(nèi)的表達水平很低，但當細胞損傷時，受IGF-1 的調(diào)控，PI3K 活化，同時表達水平快速升高[27]。損傷時，PI3K 的p85 調(diào)節(jié)亞基被募集，相較正常時表達增加，與p110亞基結(jié)合，PI3K活化，促使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[10，28]。PIP3作為第二信使[29]，招募磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）和AKT 信號蛋白，三者互相結(jié)合，通過Ser473位點的磷酸化而激活，調(diào)節(jié)細胞生長因子來促進細胞存活[30]。經(jīng)沖擊波干預后，該條信號通路被更大程度激活，調(diào)控Myod1、Myogenin 表達增加，Myostatin表達減少，增強骨骼肌再生修復。

本研究結(jié)果提示，IGF-1 /PI3K/AKT 信號通路的激活很可能參與了沖擊波治療骨骼肌鈍挫傷的作用機制，通過該通路調(diào)控相關(guān)成肌因子的表達，從而修復損傷。

4 結(jié)論

本研究對沖擊波治療骨骼肌鈍挫傷的作用機制進行了初步探討，結(jié)果表明沖擊波能夠上調(diào)IGF-1 的表達，進一步調(diào)控p-AKT 磷酸化水平，激活I(lǐng)GF-1/PI3K/AKT 信號通路，調(diào)節(jié)成肌相關(guān)指標Myod1、Myostatin 和Myogenin的變化，從而促進肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化，對鈍挫傷后骨骼肌的再生修復起到正向調(diào)節(jié)作用。