GLP-1對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂肪變性的影響

李丹丹，劉揚，韓家凱，高威，于彤，龐嫵燕

(河南大學淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河南 開封 475000)

隨著人口老齡化、酒精濫用、肥胖癥在全球流行趨勢逐日加重，脂肪性肝病已逐漸替代病毒性肝炎成為終末期肝病的重要病因。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)根據(jù)疾病進展的不同階段分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纖維化和肝硬化[1]。肝臟脂肪變性是NAFLD的早期階段，若不加干預，可進展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，甚至誘發(fā)肝細胞癌[2]。NAFLD發(fā)病機制目前認為主要是脂肪組織的胰島素抵抗，誘發(fā)氧化應激及炎癥反應，進而導致組織損傷[3]，因此也被認為是代謝綜合征的一部分[4]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)由腸道L細胞分泌，是目前已知作用最強的腸促胰島素分泌肽。動物和人體實驗均發(fā)現(xiàn)GLP-1能夠顯著改善脂肪細胞的胰島素敏感性，且在降低血糖同時改善血脂代謝。本課題從動物實驗入手，研究和分析GLP-1對NAFLD的治療效果。

1 資料與方法

1.1 實驗動物雄性約4周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，體質(zhì)量為(140±10)g，購自河南大學實驗動物中心。在適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為空白對照組(control group，CON組)，模型對照組(high-fat diet，HFD組)和GLP-1低、中、高劑量治療組(GLP-1 low、middle、high dose，GLD組、GMD組、GHD組)，每組30只。每天12 h燈光照射，室內(nèi)溫度控制23～25 ℃，濕度40%～50%。對所有動物的飼養(yǎng)及實驗處理均遵照河南大學實驗動物倫理委員會的章程及規(guī)定執(zhí)行。

1.2 動物模型的建立及分組對CON組全程喂食普通飼料，給予HFD組與GLP-1組高脂溶液(普通飼料88%、豬油10%、膽固醇2%)灌胃12周，促使NAFLD模型的形成。造模成功后，分別給予GLD組、GMD組、GHD組GLP-1(丹麥諾和諾德公司)0.1、0.2、0.4 mg·kg-1·d-1。

1.3 標本的采集及處理每周準確稱大鼠體質(zhì)量，分別于治療第4周和第8周禁食12 h后予水合氯醛麻醉后用注射器心臟尖端取血，離心后取上清液，凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)。計算治療前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況及肝指數(shù)(肝重占總體質(zhì)量的百分比)。

1.4 血和肝臟生物化學指標的測定監(jiān)測CON組和HFD、GLD、GMD、GHD組大鼠血清膽紅素、蛋白、肝功能、血脂、空腹血漿葡萄糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)等變化情況。測定總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽固醇(total chloesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholestero，HDL-C)、FBG的方法為氧化酶法，檢測FINS、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate transaminase，ALT)的方法為酶聯(lián)免疫法。由公式(FBG×FINS/22.5)計算胰島素抵抗指數(shù)(Homa insulin resistance index，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝組織50 mg，應用氯仿/甲醇制備肝組織勻漿并提取脂質(zhì)，采用GPO-PAP法測定肝臟TC、TG水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況干預過程中CON組活動度好，飲食正常，皮毛整潔。HFD組活動減少，飲食增多，毛發(fā)凌亂黃膩。GLP-1干預組大鼠的一般情況與CON組相似。

2.2 大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)治療開始時各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療8周后GLD組與HFD組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GMD組、GHD組與HFD組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CON組相比，HFD組肝指數(shù)明顯升高。治療4周后GLD、GMD、GHD組較HFD組有一定的改善，但除GHD組外，其他3組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療8周后3個治療組相較于HFD組降低(P<0.05)。見表1。

2.3 血清學代謝指標治療4周后，GLD、GMD、GHD組DBIL、IBIL以及CHO、TG、LDL-C、AST、ALT相較于HFD組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療8周后下降更明顯(P<0.05)；治療4、8周后GLD、GMD、GHD組HDL-C、TP、ALB較HFD組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GLD、GMD、GHD 3組間比較，GHD組較GLD組變化更明顯(P<0.05)。見表2、3。

表1 各組大鼠處死時體質(zhì)量及肝指數(shù)比較

注：與HFD組比較，aP<0.05。

表2 治療4周后各組大鼠血清學指標比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT—谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

表3 治療8周后各組大鼠血清學指標比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；與GLD組比較，bP<0.05；DBIL—直接膽紅素；IBIL—間接膽紅素；TC—總膽固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT—谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TP—總蛋白；ALB—白蛋白。

2.4 肝臟氧化和抗氧化能力高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠模型肝勻漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)明顯降低。治療4周后，GLD、GMD、GHD與HFD組相比，各指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療8周后，各項指標進一步接近于CON組，與HFD組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GHD組變化更明顯，且與GLD組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 治療4、8周后各組大鼠肝臟氧化和抗氧化能力比較

注：與CON組比較，aP<0.05；與治療4周后HFD組比較，bP<0.05；與治療8周后HFD組比較，cP<0.05；與治療8周后GLD組比較，dP<0.05；GSH—谷胱甘肽；SOD—超氧化物歧化酶；MDA—丙二醛。

2.5 HOMA-IR高脂飲食后HFD組NAFLD大鼠HOMA-IR明顯升高，治療4周后，GLD、GMD、GHD組與HFD組相比改善明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3個治療組呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢，GHD組降低最明顯，與GLD組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療8周后，改善趨勢與治療4周后一致，但較治療4周后有進一步的降低。見表5。

表5 治療4、8周后各組大鼠HOMA-IR比較

注：與HFD組比較，aP<0.05；HOMA-IR—胰島素抵抗指數(shù)。

3 討論

在大多數(shù)發(fā)達國家中，NAFLD已經(jīng)成為一種最為常見的肝病。肝臟在糖脂代謝中起關(guān)鍵作用，因此，NAFLD是許多代謝性疾病的風險因素，如2型糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥及動脈粥樣硬化等。目前，NAFLD和2型糖尿病已經(jīng)成為嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[5]。NAFLD在普通成年人中的發(fā)生率為10%～24%，在肥胖和2型糖尿病人群中發(fā)病率高達58%～74%和49%～62%。NASH患者2型糖尿病的發(fā)病率超過50%[6]。糖尿病是一個強大且獨立的NAFLD危險因素，二者互為條件加速惡化，有致死的風險[7]。另外非酒精性肝炎可通過釋放炎性介質(zhì)、血栓形成物及促氧化物質(zhì)以及通過NAFLD對胰島素抵抗及動脈粥樣硬化的促進作用，促進心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明，NAFLD的臨床負擔并不局限于肝臟相關(guān)疾病，大多數(shù)NAFLD患者的首要死亡原因是心血管疾病[7]。

關(guān)于NAFLD的具體發(fā)病機制尚不明確，以前主要觀點是“二次打擊”假說[2,8]：代謝失衡和氧化應激。目前，“雙重打擊”學說替代“二次打擊”學說成為一種更加科學的解釋[9-10]：多種因素共同作用于易感個體最終導致NAFLD的發(fā)生。這些因素包括胰島素抵抗、脂肪組織分泌的激素、營養(yǎng)因子、腸道微生物群以及遺傳和表觀遺傳因子，其共同作用會改變肝細胞脂肪含量并影響肝臟炎癥環(huán)境，從而通過異質(zhì)性肝細胞損傷途徑導致慢性肝臟炎癥的發(fā)生，并可能發(fā)展為肝細胞壞死，肝星狀細胞的活化和纖維基質(zhì)的沉積。胰島素抵抗是NAFLD的一個基本特征，也是促進該病進展的重要機制。研究證實，胰島素抵抗與肝細胞內(nèi)甘油三酯的異常積累緊密相關(guān)[11]。脂肪酸主要來源于脂肪組織內(nèi)的脂肪分解、飲食攝入和從頭合成，在肝臟中，游離脂肪酸可以重新酯化為甘油三酯，進行β-氧化或作為極低密度脂蛋白排泄，胰島素抵抗會使胰島素抑制肝糖輸出的能力下降，導致游離脂肪酸向肝臟的通量增加以及甘油三酯的產(chǎn)生增加，從而形成NAFLD。在高胰島素血癥中，SREBP-1c的上調(diào)導致糖異生基因的過度表達，導致脂質(zhì)積聚到肝臟中，從而形成NAFLD。鑒于此，NAFLD防治指南(2018更新版)提出：鑒于NAFLD是肥胖和代謝綜合征累及肝臟的表現(xiàn)，大多數(shù)患者肝組織學改變處于單純性脂肪肝階段，治療NAFLD的首要目標為減肥和改善胰島素抵抗，預防和治療代謝綜合征、2型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥，從而減輕疾病負擔，改善患者的生活質(zhì)量并延長壽命[12]。

GLP-1作為一種葡萄糖依賴性的腸促胰素，食物刺激后由小腸L細胞分泌入血，主要作用于胰腺β細胞，葡萄糖依賴性地刺激胰島素分泌，抑制α細胞分泌胰高血糖素，抑制食欲以及胃排空，促進胰島β細胞增殖，抑制其凋亡[13-14]。還有研究顯示，GLP-1上調(diào)脂肪細胞表面胰島素受體及胞內(nèi)胰島素底物的數(shù)量，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運子4的表達，進而改善由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導的胰島素抵抗。另外，GLP-1能夠通過降低脂肪細胞內(nèi)巨噬細胞的浸潤，直接抑制炎癥信號通路，從而改善胰島素抵抗，進而對NAFLD起到明顯的改善作用[15]。本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠成功建立NAFLD模型，HFD組肝臟質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量百分比第8周時高達(3.11±0.52)%，超過CON組的(2.38±0.24)%。這表明脂肪顆粒已經(jīng)大量附著在肝細胞。該模型具有NAFLD的典型病理特征，如肝細胞腫脹，體積增大，廣泛的大細胞性脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)大小不等的脂滴空泡，匯管區(qū)有炎癥細胞浸潤。血清學指標ALT、AST、TBIL、DBIL顯著增高。另外，高脂飲食導致肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙，血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，TP和ALB水平升高。GLP-1干預治療后，大鼠肝臟的脂肪變性得以改善，肝臟所占大鼠體質(zhì)量百分比與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明GLP-1可明顯減少NAFLD肝臟中沉積的脂肪顆粒，起到保護肝臟的作用。大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及上述血清學指標均有顯著改善，這提示GLP-1能顯著改善NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂。

氧化應激、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應是NAFLD發(fā)病中的又一次打擊。發(fā)生NAFLD時，肝細胞中過剩的游離脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的活性氧簇，一方面促使TNF-α生成，抑制線粒體呼吸，誘發(fā)并加重胰島素抵抗；另一方面活化轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)錄因子等多種細胞因子，進一步加重肝脂肪變性、壞死及纖維組織生成。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的氧化終產(chǎn)物，MDA的量可間接反映細胞損傷的程度。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。GSH結(jié)構(gòu)中含有一個活潑的巰基，易被氧化脫氫[16]。本實驗也顯示，在NAFLD大鼠模型的血漿中，氧化因子MDA升高，抗氧化指標(SOD、GSH)降低(P<0.05)。GLP-1治療8周后，上述指標明顯改善。這提示在NAFLD中，GLP-1可通過減輕炎癥反應和提高抗氧化能力改善肝功能。

綜上所述，GLP-1可以改善NAFLD大鼠肝功能，降低肝臟脂肪含量，改善肝臟抗氧化能力和胰島素抵抗，對NAFLD有治療作用。