一種新的適用于拉曼成像的插值方法

席 楊， 李月娥

蘭州大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000

引 言

隨著人類對(duì)生命科學(xué)的不斷探索， 從亞顯微水平對(duì)細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、 功能、 物質(zhì)間傳輸進(jìn)行活性定位與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)， 對(duì)于生命結(jié)構(gòu)的理解以及疾病的診治都有著十分重要的意義。 而拉曼光譜能夠揭示分子的振動(dòng)信息， 同時(shí)兼具無(wú)損、 非接觸、 指紋性的優(yōu)點(diǎn)， 使得拉曼檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)， 化學(xué)和材料科學(xué)等諸多學(xué)科中[1-3]。

拉曼成像是一種特殊的成像技術(shù)， 它通過(guò)采集樣本某點(diǎn)處的拉曼信號(hào)， 選擇指定譜峰的強(qiáng)度、 譜峰面積或者譜峰寬等參數(shù)并以灰度圖或偽色圖的形式顯示， 圖像明暗、 色彩的變化與指定譜峰所代表的物質(zhì)成分相對(duì)應(yīng)， 便可提供物質(zhì)的濃度、 分布狀況等生物信息。

從人力、 財(cái)力、 耗時(shí)的角度來(lái)看， 拉曼檢測(cè)的采集點(diǎn)不宜過(guò)多， 從采集信息的完整度來(lái)看， 采集點(diǎn)又不宜太少， 通常實(shí)驗(yàn)得到的拉曼成像含有有限的像素點(diǎn)， 為了滿足人們的視覺(jué)要求， 一般要對(duì)它進(jìn)行插值放大(即分辨率增強(qiáng))。 目前關(guān)于圖像插值方法的研究， 包括廣泛使用的最近鄰域法、 雙線性內(nèi)插法、 三次樣條內(nèi)插法[4-5]， 以及基于小波變換的圖像插值方法[6-8]。 使用這些方法對(duì)常規(guī)的圖像進(jìn)行處理的實(shí)質(zhì)是根據(jù)已知像素點(diǎn)， 選擇合適的插值函數(shù)進(jìn)行插值， 其結(jié)果是像素點(diǎn)有所增加， 視覺(jué)效果得到改善， 但對(duì)于拉曼檢測(cè)， 還需考慮采集點(diǎn)處采集信息的真實(shí)分布情況。 此外， 如圖1所示， 兩個(gè)采集點(diǎn)處都是以高斯光束進(jìn)行激發(fā)，d表示兩個(gè)采集點(diǎn)之間的距離， 如果要在兩個(gè)采集點(diǎn)之間進(jìn)行插值， 則需考慮相鄰高斯光束之間存在交疊的現(xiàn)象， 理論上， 該處插值受附近采集點(diǎn)處高斯光束的共同影響。 本文將基于這些特性提出一種更合理的適用于拉曼成像的插值方法。

圖1 兩個(gè)相鄰采集點(diǎn)處的高斯光束存在交疊

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 信息采集

我們以共振拉曼探針標(biāo)記的細(xì)胞成像為例[9]， 對(duì)新插值方法進(jìn)行檢測(cè)。 拉曼信號(hào)的采集使用了Witec共焦拉曼系統(tǒng)， 激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm， 激光功率為5 mW， 每點(diǎn)處拉曼信號(hào)的積分時(shí)間為1 s。 采集區(qū)域的面積為22 μm×22 μm, 一共采集了32×32個(gè)點(diǎn)， 可知相鄰像素點(diǎn)之間的距離為22/31 μm, 物鏡采用Plan Apo 60 NA=1.4 (Nikon, Japan)的油鏡， 高斯光束的束腰直徑約為1 μm。

1.2 光譜預(yù)處理

由于受實(shí)驗(yàn)儀器、 環(huán)境以及熒光的影響， 采集的拉曼信號(hào)通常含有較大的噪聲與背景漂移[10-11]。 事實(shí)上， 光譜采集的過(guò)程中， 來(lái)自環(huán)境中的宇宙射線、 α射線和γ射線也會(huì)照射到探測(cè)器上并形成一系列非常尖銳的譜峰， 其寬度通常不超過(guò)2 cm-1， 稱為尖峰。 本文中， 我們使用已有的處理方式完成去尖峰[12]、 去噪[13]和基線校正[14]。 我們從32×32個(gè)采集點(diǎn)中選擇采集點(diǎn)(15, 7)處的拉曼信號(hào)進(jìn)行呈現(xiàn)， 如圖2所示， 這里指定譜峰的波數(shù)范圍為1 027～1 480 cm-1。 此外， 由于受實(shí)驗(yàn)儀器的影響， 光譜左端區(qū)域1內(nèi)存在較大漂移， 因此我們統(tǒng)一對(duì)1 024個(gè)采集點(diǎn)的光譜左端進(jìn)行了截?cái)嗵幚怼?/p>

圖2 采集點(diǎn)(15, 7)處的拉曼信號(hào)

1.3 原始成像

對(duì)每個(gè)采集點(diǎn)處的拉曼信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理， 選擇指定譜峰的面積作為返回參數(shù)， 并進(jìn)行歸一化顯示， 得到對(duì)應(yīng)該采集區(qū)域的灰度圖及偽色圖(綠色)， 如圖3所示， 圖像中的明暗分別對(duì)應(yīng)了細(xì)胞中被標(biāo)記線粒體濃度的高低。

圖3 共振拉曼探針標(biāo)記的線粒體拉曼成像

2 基本原理

我們選擇將原始成像放大兩倍(即64×64個(gè)像素點(diǎn))來(lái)說(shuō)明插值的思想。 通過(guò)取兩個(gè)相鄰高斯光束的中心垂直截面得到如圖4中對(duì)應(yīng)的f(x)截面函數(shù)，d表示兩個(gè)采集點(diǎn)a和c之間的距離,b為a與c的中心插值點(diǎn)， 高斯光束的截面函數(shù)f(x)由式(1)給出， 其中，x表示插值點(diǎn)到采集點(diǎn)之間的距離。

(1)

需要注意的是， 實(shí)驗(yàn)中采集的拉曼信號(hào)與高斯光束的能量成正比， 高斯光束能量的截面函數(shù)由式(2)給出， 對(duì)應(yīng)圖4中的函數(shù)f2(x)。

(2)

此外， 拉曼信號(hào)的采集不是指單點(diǎn)處的采集， 而是以采集點(diǎn)為中心指定區(qū)域內(nèi)的采集， 指定區(qū)域由高斯光束能量函數(shù)的束腰決定。 如圖5所示為圖1中兩個(gè)高斯光束能量的俯視圖， 兩個(gè)采集點(diǎn)處的采集區(qū)域分別為圖5中兩個(gè)虛線圓所對(duì)應(yīng)的部分， 虛線圓的直徑即為對(duì)應(yīng)的高斯光束能量的束腰直徑， 這里模擬的是相鄰采集點(diǎn)處采集區(qū)域(即虛線圓部分)相切的情形， 而這也是本文實(shí)現(xiàn)插值的關(guān)鍵， 后面將詳細(xì)介紹。

圖4 采集點(diǎn)a和c處高斯光束的截面函數(shù)f(x)及其能量的截面函數(shù)f2(x)

Fig.4 The cross-sectional functionf(x) of the Gaussian beam at pointsa，cand the cross-sectional function of its energyf2(x)

圖5 相鄰采集點(diǎn)處高斯光束能量的俯視圖

我們知道， 高斯光束的束腰是由峰強(qiáng)下降到最大峰強(qiáng)的e-1所決定的， 將其代入式(1)可得

(3)

已知本文中使用的束腰為1 μm, 所以x=0.5 μm， 可以得到

w=x=0.5

(4)

將w代入式(2)得

(5)

從而得到各個(gè)采集點(diǎn)處高斯光束的能量函數(shù)

(6)

其中，Bi表示第i個(gè)采集點(diǎn)處高斯光束能量函數(shù)的幅值，x與y分別對(duì)應(yīng)高斯光束在水平面沿x軸與y軸到中心處的距離， 每個(gè)采集點(diǎn)處面積參數(shù)是已知的， 通過(guò)對(duì)式(6)選擇以束腰直徑的指定區(qū)域并對(duì)其積分可反推出每個(gè)采集點(diǎn)對(duì)應(yīng)的系數(shù)Bi， 進(jìn)而得到每個(gè)采集點(diǎn)處真實(shí)的高斯光束的能量函數(shù)， 由于各個(gè)像素點(diǎn)處的值不一致， 與其對(duì)應(yīng)的能量函數(shù)的幅值也不盡相同， 但是束腰仍然是統(tǒng)一的。

拉曼信號(hào)采集過(guò)程中， 在選定高斯光束束腰的前提下， 調(diào)整采集間隔， 使相鄰采集點(diǎn)的間距和高斯光束能量函數(shù)的束腰直徑滿足d=2k。 如圖6所示為相鄰采集點(diǎn)a和c處高斯光束能量的截面圖， 當(dāng)滿足d=2k時(shí)[圖6(a)]， 中心插值點(diǎn)b處估計(jì)值由a2和c1兩部分構(gòu)成， 此時(shí)b處估計(jì)值剛好為a和c處值之和的一半， 這種處理方式符合插值要求， 且不會(huì)產(chǎn)生比所依賴像素點(diǎn)的最大值大的插值。 當(dāng)d>2k時(shí)[圖6(b)]， 中心插值點(diǎn)b處預(yù)測(cè)值由b1和b2兩部分構(gòu)成， 此時(shí)b處估計(jì)值明顯小于a和c處值之和的一半， 這是因?yàn)椴杉g隔較大， 采集點(diǎn)之間存在一小段未采集區(qū)域?qū)е碌模?基于此得到的插值普遍較小， 成像效果隨d>2k程度的變大而變差。 當(dāng)d<2k時(shí)， 采集間隔較小， 理論上中心插值點(diǎn)b處估計(jì)值會(huì)產(chǎn)生比所依賴像素點(diǎn)的最大值大的插值， 這是不符合插值要求的， 同時(shí)消耗的實(shí)驗(yàn)資源也比較多。

圖6 相鄰采集點(diǎn)a和c處高斯光束能量的截面圖

圖7 插值點(diǎn)b處插值的形成

3 結(jié)果與討論

為了便于理解， 我們以四個(gè)原始像素點(diǎn)(對(duì)應(yīng)采集點(diǎn)處的面積參數(shù))為例， 對(duì)其放大兩倍的具體步驟如圖8所示， 插值過(guò)程如下：

(1)選定四個(gè)原始像素點(diǎn)， 相鄰像素點(diǎn)之間的距離為d。

(2)進(jìn)行邊界延拓， 本文中的處理方法是讓邊界點(diǎn)的值與前一個(gè)原始像素點(diǎn)的值保持一致。

(3)以小框中的像素點(diǎn)為例， 水平或垂直相鄰的像素點(diǎn)之間的插值點(diǎn)由前后或上下像素點(diǎn)處的值決定， 而四個(gè)像素點(diǎn)中心的插值點(diǎn)由周圍四個(gè)像素點(diǎn)共同決定。

(4)將步驟(3)中的小框看作一個(gè)運(yùn)行窗， 遍歷所有像素點(diǎn)得到(4)中的處理結(jié)果， 可以看到(4)中大框右側(cè)與底部的邊界點(diǎn)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)插值， 對(duì)其忽略， 這樣(4)中大框即為二倍插值的結(jié)果。

圖8 以放大兩倍為例的插值步驟

基于上述插值原理對(duì)原始成像進(jìn)行插值， 得到放大后的圖像(64×64個(gè)像素點(diǎn))如圖9所示， 通過(guò)對(duì)比放大前后的成像可以看到， 原始圖像由于像素點(diǎn)較少， 視覺(jué)上存在嚴(yán)重的馬賽克現(xiàn)象， 而放大后的圖像由于像素點(diǎn)增加， 成像效果更為舒適， 現(xiàn)實(shí)中我們可以根據(jù)實(shí)際要求將該方法推廣至更高的放大倍數(shù)。

圖9 基于新的插值方法放大兩倍的效果

4 結(jié) 論

介紹了拉曼成像的基本原理， 并重點(diǎn)闡述了一種適用于拉曼成像放大的新方法， 該方法基于采集點(diǎn)處信息與高斯光束能量之間的聯(lián)系， 在符合插值要求的情況下對(duì)拉曼成像實(shí)現(xiàn)插值放大， 同時(shí)對(duì)成像進(jìn)行插值放大亦可大大降低采集相同像素點(diǎn)數(shù)目所耗的時(shí)間。 將新方法應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)采集到的拉曼成像中， 得到了良好的放大效果， 同時(shí)我們相信該方法可以作為拉曼成像放大處理的有力工具。 此外， 該新方法還具有在其他光譜成像放大中應(yīng)用的潛在價(jià)值。