一株具有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌的篩選、鑒定及生物學特性研究

蔣凱麗， 周新麗*， 高海燕

1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093;2.上海大學生命科學學院，上海 200444

櫻桃番茄又被稱為圣女果、小西紅柿，為多汁漿果，具有果皮薄、怕擠壓、呼吸作用強和富含糖分等特點，極易受真菌感染，耐貯性差，因此櫻桃番茄的采后保鮮一直是影響果農(nóng)收入的主要問題。櫻桃番茄果實的采后病害[1,2]主要有灰霉病、炭疽病、根霉果腐病等，對于櫻桃番茄病害的防治，目前仍已化學殺菌劑為主，然而長期使用化學試劑不僅會誘導果蔬的耐受性，還會對食品安全和生態(tài)環(huán)境造成一系列負面影響。

研究發(fā)現(xiàn)[3]自然界中存在一些微生物，能夠有效抑制果實表面菌絲生長，防止由于病原菌侵染導致的果蔬采后腐爛，實現(xiàn)采后保鮮，即生物防控。如一些熒光假單胞菌菌株[4]可以有效控制番茄灰霉病，枯草芽孢桿菌菌株[5-7]能夠有效地控制柑橘的青霉病、櫻桃的褐腐病，解淀粉芽孢桿菌[8-10]可以抑制西瓜?；图怄哏牭毒?、石榴枯萎病等，這種方法不僅能防御采后病害，而且不會對環(huán)境造成污染。但是目前生物防控在實際應用中仍存在許多問題，包括在商業(yè)條件下效果的不一致性、對波動的環(huán)境條件的有限耐受性以及耐儲存制劑生產(chǎn)困難，因此國內(nèi)外學者致力于研究高效、穩(wěn)定和具有廣譜抑菌性的生物防治細菌。

從果實、植物根部、土壤等[11,12]分離出的生物防治細菌比其他來源更安全，本文擬通過平板對峙試驗，從櫻桃番茄成熟紅果上分離篩選對其采后病原菌有抑制作用的生物防治細菌，并對其形態(tài)特征、生理生化特性、生物學特性進行研究，以期為進一步研究開發(fā)高效穩(wěn)定安全的生防治劑、解決果蔬采后腐爛變質(zhì)的病害控制提供理論依據(jù)，為果蔬采后保鮮工作做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

病原真菌：極細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，黑曲霉(Aureobasidiummelanogenum)，青霉菌(Penicilliumoxalicum)，尖側多隔孢霉(Pleurophragmiumacutum)，擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)，鹽生枝孢霉(Cladosporiumhalotolerans)，子囊菌(Ascomycota)，膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)均由上海大學生命科學學院食品質(zhì)量與安全控制實驗室篩選分離自櫻桃番茄并保存。

試劑：牛肉浸膏、酵母浸膏、氯化鈉、魚粉蛋白胨、葡萄糖和瓊脂均購于上海國藥集團化學試劑有限公司，HBI芽孢桿菌生化鑒定條購于青島海博生物技術有限公司，馬鈴薯購自菜市場。

1.2 儀器與設備

YP5001 電子天平，上海菁海儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-B11-600-S-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；DHZ-DA 大容量全溫振蕩器，太倉市實驗設備廠；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PB-10 pH計，北京賽多利斯科學儀器有限公司；臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；C1000Touch PCR儀，上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基制備

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(LB)：牛肉浸膏5 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉5 g，魚粉蛋白胨10 g，自來水定容至1 000 mL，pH調(diào)整為7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于拮抗細菌的培養(yǎng)。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎上再加瓊脂粉18 g。

葡萄糖馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)：200克馬鈴薯去皮切成小塊后置于600 mL蒸餾水中煮沸20 min，8層紗布過濾后取其上清液，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，等待其溶解后用自來水定容至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2拮抗細菌KL-1分離、純化

根據(jù)五點取樣方法，在上海躍科蔬菜原種場取櫻桃番茄成熟紅果，每份樣品分別稱取10 g，加入90 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃下150 r/min轉(zhuǎn)速震蕩48 h，然后用無菌移液器吸取1ml菌液，用滅菌蒸餾水濃度梯度稀釋成10-1至10-7的濃度，將10-5、10-6和10-7濃度的菌液分別取0.1 mL涂布倒于LB培養(yǎng)基平板上。每個稀釋度重復三次，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后將每個平板上的單菌落劃線到其他新鮮平板上以進行菌種的純化。

1.3.3拮抗細菌KL-1的篩選[13-15]

初篩：取極細鏈格孢菌病原菌菌塊置于PDA平板中央，在距離病原菌菌塊2 cm兩側點接純化的待篩選細菌，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察兩個菌落生長情況，是否有抑菌圈產(chǎn)生，篩選出對病原菌表現(xiàn)抑制的菌株。

復篩：取八種病原菌菌塊置于PDA平板中央，用接種環(huán)挑取有抑菌效果的細菌點接在距平板中央3 cm處的4個角點上，放入培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，每組處理做三個平行，試驗重復兩次。以只接種病原菌的PDA平板培養(yǎng)基作對照，觀察病原菌的生長狀態(tài)，測量病原菌菌落直徑，計算菌株的抑制率。

1.3.4菌株KL-1的鑒定[16,17]

1.3.4.1KL-1形態(tài)特征鑒定

將待測菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落的顏色、形態(tài)、透明度等特征，并通過使用光學顯微鏡和革蘭氏染色觀察細胞形態(tài)。

1.3.4.2KL-1生理生化特性鑒定

V-P試驗、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、D-木糖利用、L-阿拉伯糖利用、D-甘露醇利用、明膠液化試驗、7%NaCl生長、pH 5.7生長、硝酸鹽還原、淀粉水解、厭氧性測定，每個處理三次重復。

1.3.4.3KL-1分子生物學鑒定

對KL-1進行16S rDNA鑒定，將菌種接種在LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，然后用生工公司的細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株的DNA。PCR擴增：使用細菌16S rDNA基因通用引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR擴增采用50 μL反應體系，其中：10×PCR buffer 5 μL；dNTP 4 μL；引物各1 μL；TaqDNA酶0.4 μL；模板2 μL；用ddH2O補足到50 μL。PCR擴增的反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，最后在72 ℃保溫10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具對序列進行同源性分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5菌株KL-1的生物學特性研究[18,19]

1.3.5.1種子培養(yǎng)液的制備

將在LB固體培養(yǎng)基上預先活化的KL-1接入滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min培養(yǎng) 24 h，用無菌蒸餾水將濃度調(diào)至1×108CFU/L，即為KL-1種子培養(yǎng)液。

1.3.5.2生長曲線的測定

接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)。取菌體培養(yǎng)液5 mL，每隔3h用分光光度計在600 nm 波長下測吸光度，觀察曲線情況，至少測至48 h。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，校正零點，每處理3個重復。

1.3.5.3最適生長pH的測定

配制LB 液體培養(yǎng)基，用NaOH分別調(diào)成100 mL pH為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，滅菌后分別接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液于100 mL調(diào)至不同pH的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)，48h后用紫外可見分光光度計在 600 nm 波長下測其吸光度。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，每處理3個重復。

1.3.5.4最適生長溫度的測定

接種1 mL KL-1種子培養(yǎng)液于100 mL pH 為 7.0 的 LB 液體培養(yǎng)基中，于 20 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)，48 h后用分光光度計在600 nm波長下測其吸光度。以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，每處理3個重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0軟件進行，實驗均設三次重復，結果表達采用平均值±標準誤差，運用Origin 2019b進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 菌株KL-1的篩選

以櫻桃番茄成熟紅果為樣本，櫻桃番茄最常見的病原真菌極細鏈格孢菌為指示菌，通過平板拮抗試驗，從櫻桃番茄成熟紅果上篩選得到一株抑菌效果明顯的拮抗細菌，將其命名為KL-1。再對其進行復篩，結果見圖1。從圖中可看出，拮抗細菌KL-1對于七種病原菌：極細鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌、擬康寧木霉、鹽生枝孢霉、子囊菌和膠孢炭疽菌都有明顯的抑制作用，其中KL-1對黑曲霉的抑制率最大為81%，對其他六種病原菌抑制率也均高于70%，對尖側多隔孢霉的抑制率為0，說明菌株KL-1具有廣譜抑菌性，可以抑制番茄中的多種病原真菌。

圖1 KL-1對病原菌的抑制率

2.2 菌株KL-1的鑒定

2.2.1形態(tài)學鑒定

菌株KL-1在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h后，菌落形態(tài)呈規(guī)則圓形，邊緣整齊，淡黃色無光澤，不透明(圖2)。光學顯微鏡(×100油鏡)下觀察，菌體細胞呈短桿狀，革蘭氏染色呈陽性(圖3)。

2.2.2生理生化鑒定

如表1所示，KL-1菌株V-P試驗呈陽性反應，不能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，能利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇，能液化明膠，在7%NaCI不可以生長，pH 5.7可以生長，硝酸鹽還原呈陽性反應，能水解淀粉，無法在厭氧條件下生長。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中有關芽孢桿菌種屬鑒別特征的描述，初步推測該菌為芽孢桿菌屬，具體種還需要進一步鑒定。

圖2 KL-1在LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)12 h后的菌落形態(tài)

圖3 光學顯微鏡下KL-1的菌體形態(tài)

表1 KL-1生理生化特性

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.2.3分子生物學鑒定

擴增出拮抗細菌KL-1的16S rDNA片段序列全長為1 483 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性分析，結果表明KL-1菌株與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的部分序列同源性達 99%以上。隨后利用 MEGA 7.0軟件構建出系統(tǒng)進化樹(圖4)，結果顯示 KL-1與解淀粉芽孢桿菌(KY357304.1)的遺傳距離最近，再一次證實生防菌KL-1屬于解淀粉芽孢桿菌。綜合以上各項實驗結果，可以鑒定KL-1為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

2.3 菌株KL-1的生物學特性研究

2.3.1KL-1生長曲線

圖5為在600 nm波長下，經(jīng)過不同培養(yǎng)時間后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖5可看出，KL-1在LB液體培養(yǎng)基中，當培養(yǎng)時間為18 h時，培養(yǎng)液的吸光度值最大。KL-1在接種到LB培養(yǎng)液后的9 h內(nèi)處于對數(shù)生長期，9 h～21 h內(nèi)處于穩(wěn)定生長期，接種21 h后進入衰老期。可見該菌生長速度較快，接種后9 h～21 h內(nèi)菌量最多。

圖4 KL-1的系統(tǒng)進化樹

圖5 KL-1生長曲線

2.3.2pH對KL-1生長的影響

圖6為在600 nm波長下，處于不同pH條件下培養(yǎng)24 h后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖6可看出，該菌在較大pH范圍內(nèi)都能生長，但pH對KL-1菌株生長影響明顯。其中pH在5～9范圍內(nèi)適宜KL-1的生長，而KL-1最適pH在7.0左右，可見該菌適宜在中性條件下生長。

圖6 pH對KL-1生長的影響

2.3.3溫度對KL-1生長的影響

圖7為在600 nm波長下，處于不同溫度條件下培養(yǎng)24 h后KL-1培養(yǎng)液的吸光度。從圖7可看出，溫度對菌株KL-1生長和繁殖有明顯的影響，在20 ℃～50 ℃范圍內(nèi)，KL-1生長和繁殖速率呈先上升后下降趨勢，最適溫度為37 ℃左右。

圖7 溫度對KL-1生長的影響

3 討論與結論

國內(nèi)外報道了很多有關生防菌防治番茄采后病害的研究，包括酵母菌等真菌類和芽孢桿菌等細菌類[20,21]。真菌類如酵母菌L-1-6[22]對番茄早疫病的抑制效果為77.8%，酵母菌BS-316[23]對番茄灰霉病的抑制效果為84.92%，；細菌類如放線菌FX-03[24]對番茄早疫病的抑制效果為75.6%，白黑鏈霉菌T22[25]對番茄灰霉病的抑制效果為55.1%，芽孢桿菌W12和W118[26]對番茄青枯病的抑制效果為62.3%。已報道的這些生防菌均探究了對番茄采后常見某一種病原菌的抑制效果。

本研究從櫻桃番茄成熟紅果上分離的菌株KL-1 的抑菌范圍比較廣泛，可以同時抑制極細鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌、擬康寧木霉、鹽生枝孢霉、子囊菌和膠孢炭疽菌這七種番茄采后常見病原菌；其抑菌率較高，其中對黑曲霉的抑制率最大為81%，其他六種病原菌抑制率也均高于70%。通過觀察菌株形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析對其進行分子生物學鑒定，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，生長曲線表明在培養(yǎng)9 h內(nèi)生長最旺盛，最適生長pH為7.0，最適生長溫度為37 ℃。該拮抗菌株在體外實驗中表現(xiàn)出很好的抑菌效果，但其如何發(fā)揮抑菌作用，是否在番茄果實上也能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果，還需進一步研究證實。