Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)前后微生物群落結(jié)構(gòu)差異性

嚴(yán) 鋒， 張 方， 袁林江

1.廣州資源環(huán)保科技股份有限公司，廣州 510699；2.中信環(huán)境技術(shù)(廣州)有限公司，廣州 510660；3.西安建筑科技大學(xué)，西安 710055

Anammox菌增殖速度慢，使得反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)而且難以富集功能菌，因此該工藝的大規(guī)模應(yīng)用受到很大限制[1]。UASB(upflow anaerobic sludge blanket)反應(yīng)器具有構(gòu)造簡(jiǎn)單、污泥截留能力強(qiáng)，培養(yǎng)的污泥沉降性能好，耐負(fù)荷波動(dòng)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常作為Anammox快速啟動(dòng)反應(yīng)器[2-4]。但UASB反應(yīng)器中污泥床在上升流速較低產(chǎn)氣量不足時(shí)，污泥床致密易導(dǎo)致基質(zhì)傳遞效果不良等問(wèn)題[5]，從而影響反應(yīng)器運(yùn)行效果。

生物反應(yīng)器的運(yùn)行及對(duì)底物的降解都依賴(lài)于系統(tǒng)微生物的組成及其功能。高通量測(cè)序技術(shù)能對(duì)污泥中微生物進(jìn)行全面細(xì)致的分析，數(shù)據(jù)量龐大。該技術(shù)在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]。在Anammox研究中也取的很好的效果[8]。本文研究了Anammox-UASB的啟動(dòng)和上升流速對(duì)反應(yīng)器脫氮的影響，以期為Anammox-UASB的快速啟動(dòng)與高效運(yùn)行提供理論指導(dǎo)和依據(jù)；采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，旨在為Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程微生物群落變化規(guī)律提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及廢水組成

實(shí)驗(yàn)裝置采用圖1所示的有效容積為6.3 L的UASB反應(yīng)器，利用溫控裝置和水泵控制反應(yīng)器溫度為33 ℃，外壁包裹黑布以防止光照對(duì)Anammox菌產(chǎn)生不利影響。

實(shí)驗(yàn)用水組成：KHCO31 000 mg/L;KH2PO427mg/L;CaCl25.6 mg/L;MgSO4·7H2O 200 mg/L;(NH4)2SO4和NaNO2按需添加；微量元素Ⅰ和Ⅱ[9]各1 mL。

圖1 Anammox-UASB裝置原理圖

1.2 接種污泥與高通量測(cè)序污泥采集和保存

反應(yīng)器接種市政污水廠回流污泥，起始污泥MLSS=7 787 mg/L，MLVSS=5 244 mg/L。經(jīng)短期反硝化預(yù)培養(yǎng)后開(kāi)始Anammox馴化。高通量測(cè)序污泥樣品為接種污泥(Y1)與Anammox培養(yǎng)180 d的污泥(Y2)。

1.3 分析方法

基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序分析交由生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)及負(fù)荷的提高

圖2 Anammox-UASB啟動(dòng)過(guò)程脫氮性能

2.2 N沖擊負(fù)荷對(duì)Anammox-UASB的影響

圖3 Anammox脫氮影響研究

2.3 上升流速對(duì)Anammox脫氮的影響

圖4 上升流速對(duì)系統(tǒng)脫氮性能影響

2.4 Anammox反應(yīng)器啟動(dòng)前后微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性

利用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)接種污泥(Y1)和Anammox污泥(Y2)進(jìn)行高通量測(cè)序，分析微生物種群結(jié)構(gòu)變化。

2.4.1菌群Alpha多樣性分析

表1為菌群分布的Alpha多樣性相關(guān)指標(biāo)?？梢钥闯觯珹nammox污泥菌群OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及ACE指數(shù)均表明Y1群落的Alpha多樣性Y2群落多樣性減少。作為小型生態(tài)系的活性污泥系統(tǒng)中某一功能的提高通常伴隨著系統(tǒng)整體微生物多樣性下降和某些功能菌豐度值提高[13]。反應(yīng)器接種污泥來(lái)源于城市污水廠，其處理廢水成分復(fù)雜并經(jīng)過(guò)厭氧、缺氧、好氧交替運(yùn)行環(huán)境，微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜。而在長(zhǎng)時(shí)間的厭氧自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，好氧菌以及異養(yǎng)菌等因DO和有機(jī)物缺乏而不適應(yīng)該環(huán)境，此類(lèi)微生物易衰亡或從反應(yīng)器流失，適應(yīng)Anammox培養(yǎng)環(huán)境的微生物繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。

表1 污泥樣品的Alpha多樣性

2.4.2菌群結(jié)構(gòu)分析

(1)門(mén)分類(lèi)水平上的分析

將Y1和Y2測(cè)序所得全部有效序列進(jìn)行聚類(lèi)分析得到的OUT進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)得到污泥菌群在門(mén)水平上的群落組成。在Y1中共檢測(cè)到23個(gè)菌門(mén)，相對(duì)豐度大于1%的門(mén)占10個(gè)；Y2中共檢測(cè)到21個(gè)菌門(mén)，相對(duì)豐度大于1%的只有5個(gè)門(mén)。表2顯示了污泥樣品主要菌門(mén)及其相對(duì)豐度情況。在Y1和Y2中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)微生物相對(duì)豐度都是最大的，分別高達(dá)50.54%和74.39%，這與大多數(shù)的anammox反應(yīng)器系統(tǒng)菌群分布相一致[8,14]。高晨晨[15]研究了9座污水廠活性污泥群落結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)Proteobacteria均主導(dǎo)菌門(mén)。其主要原因是，參與脫氮及諸多污染物質(zhì)的降解過(guò)程的微生物大都?xì)w屬于Proteobacteria[6]。在Y2中，浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)的相對(duì)豐度為3.92%，而Y1中該門(mén)的相對(duì)豐度為4.36%。目前發(fā)現(xiàn)的Anammox菌均為Planctomycetes微生物，但Y2中的Planctomycetes相對(duì)豐度較Y1卻有所下降，其因?yàn)闉楦∶咕毡榇嬖谟诔鞘形鬯幚韽S污泥系統(tǒng)中，但是該菌門(mén)中具有Anammox脫氮功能的只有6個(gè)屬[16]，在Y1中檢測(cè)到的具有Anammox功能的菌屬幾乎沒(méi)有，但Y2中檢測(cè)到大量的Candidatus_Jettenia和Candidatus_Brocadia屬(圖5)，并且隨著自養(yǎng)厭氧培養(yǎng)一些不適應(yīng)環(huán)境的腐霉菌在大量的流失消亡。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌多能產(chǎn)生芽孢，對(duì)不良環(huán)境有較好的抵抗力，對(duì)環(huán)境有較好的適應(yīng)力[16]，在Anammox啟動(dòng)過(guò)程豐度大量增加。

表2 反應(yīng)器接種污泥(Y1)與Anammox污泥(Y2)菌群門(mén)水平分析

(2)屬分類(lèi)水平上的分析

為了更深入的了解污泥群落結(jié)構(gòu)特征，對(duì)測(cè)序結(jié)果在屬水平做了如下分析。圖5是污泥樣品中相對(duì)豐度較高(>1%)的屬的分布情況。Y1中共檢測(cè)到446個(gè)屬，相對(duì)豐度大于1%的屬有25個(gè)；Y2中共檢測(cè)到259個(gè)屬，相對(duì)豐度大于1%的有11個(gè)屬。Y1中菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜并且各種菌屬的相對(duì)豐度較為相對(duì)均衡，而Y2菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。Y1中有關(guān)脫氮的菌屬主要有Acinetobacter(3.61%)、Denitratisoma(3.36%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(2.03%)、Nitrosomonas(0.12%)、Nitrosococcus(1.26%)、Nitrobacter(0.11%)、Nitrospira(1.77%)、Azoarcus(0.91%)、Sulfuritalea(0.85%)，未檢測(cè)到具有Anammox功能的菌屬。Y2中相關(guān)脫氮菌屬主要有Acinetobacter(54.63%)、Nitrosomonas(4.67%)、CandidatusJettenia(2.48%)、Denitratisoma(2.43%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(0.32%)、CandidatusBrocadia(0.84%)、Azospira(0.67%)、Nitrobacter(0.15%)、Hyphomicrobium(0.58%)，其中CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia兩個(gè)屬為典型的Anammox菌屬。Anammox污泥中不動(dòng)桿菌屬呈現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占整個(gè)菌群的54.63%，增長(zhǎng)極為明顯；在Anammox培養(yǎng)中，系統(tǒng)中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)也大量增長(zhǎng)，相對(duì)豐度有接種時(shí)的0.12%增加到4.47%，接種污泥中含有未分類(lèi)的亞硝化單胞菌科(unclassifiedNitrosomonadaceae)中的細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中有所減少；紅環(huán)菌科中的Denitratisoma屬是典型的反硝化菌，在接種污泥和Anammox污泥中相對(duì)豐度均較高，分別為3.36%和2.43%，反硝化菌的存在有利于維持反應(yīng)器內(nèi)部厭氧水平[17]，有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行。對(duì)于Planctomycetes中的細(xì)菌，Y1中Planctomycetes的相對(duì)豐度為4.36%，但具有Anammox功能的屬只占該門(mén)的0.015%，豐度極小。而Y2中Planctomycetes的相對(duì)豐度為3.92%，其中檢測(cè)到大量的Anammox功能菌，主要以CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia兩種屬為主導(dǎo)功能菌屬，分別占總細(xì)菌的2.48%和0.84%，anammox功能菌的豐度大量增高與反應(yīng)器呈現(xiàn)很好的Anammox性狀相符合。

圖5 相對(duì)豐度較高(>1%)的屬分布情況

3 結(jié)論

以A2/O回流污泥為接種污泥經(jīng)短時(shí)間反硝化培養(yǎng)后，歷時(shí)35 d成功啟動(dòng)了Anammox-UASB反應(yīng)器，氮去除速率達(dá)到122 mgN/(L·d)。

高通量測(cè)序結(jié)果表明，隨著Anammox培養(yǎng)，污泥微生物群落多樣性下降，說(shuō)明系統(tǒng)厭氧氨氧化功能的增強(qiáng)伴隨著功能菌豐度的提高和多種不適應(yīng)環(huán)境的微生物的淘汰。

Anammox污泥中以Proteobacteria、Firmicutes、Planctomycetes為主要菌門(mén)。本系統(tǒng)Anammox功能菌為Candidatus_Jettenia(2.48%)和Candidatus_Brocadia(0.84%)兩個(gè)屬。