兒茶素調控MAPK通路改善幼鼠過敏性氣道炎癥反應的機制研究

張小華 朱小輝

湖北省天門市第一人民醫(yī)院兒科431700

過敏性哮喘為臨床多見慢性炎癥性疾病,支氣管哮喘(哮喘)患者起病與進展中其體內炎癥反應有重要影響,可能為哮喘發(fā)病機制之一[1]。全世界范圍內約有近20%的人曾患過敏性疾病,對人們的生活質量造成了一定影響[2]。過敏性哮喘主要發(fā)病人群為兒童群體,相關研究顯示,我國兒童哮喘發(fā)病率在3.3%左右,且有逐年升高趨勢[3]。當前,臨床上治療哮喘的藥物對患兒臨床癥狀控制效果并不理想,若患兒長時間采用糖皮質激素則會影響到其生長發(fā)育[4]。因此,探究過敏性哮喘對患兒的影響及相關機制,積極尋求有效且不良反應少的藥物有重要臨床價值。我國已有數(shù)千年的飲茶文化,茶葉已成為人們日常生活中主要保健品之一。兒茶素最初是從茶葉內取的,為茶葉內含黃銅類成分最多化合物,具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性[5]。因此,本研究經過分析兒茶素調控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路改善幼鼠過敏性氣道炎癥反應的機制,為臨床患兒診療提供一些借鑒。

1 資料與方法

1.1 實驗小鼠 選取SPF級BALB/c純系小鼠50只,4周齡,購自北京維通利華實驗動物公司,許可證號:SCXK(京):2019-04,體質量(18.27±1.10)g,體質量范圍為15～20 g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實驗,小鼠分籠飼養(yǎng),每個籠內5只,室溫維持在22℃～26℃,相對濕度為55%～65%,晝夜循環(huán),保持12 h光照,小鼠灌胃、添加飼料及換水等都由專人進行。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 地塞米松磷酸鈉注射液購自白云山天星制藥公司(規(guī)格:1 mg∶5 mg),兒茶素購自江西海富生物公司(純度＞90%),IL-4、IL-5及IL-13試劑盒購自南京建成生物研究所,亂蛋白凍干粉購自美國Sigma公司(規(guī)格:10 mg/支),鼠源p-p38MAPK、細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38MAPK及p-ERK單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

電熱恒溫鼓風干燥箱(型號:DHG-9023A)、數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號:PYXDHS)、漩渦混合器(型號:XW-80A)、離心機(型號:TGL-168)均由美國KIMBLE公司生產,PCR擴增儀由美國PE公司生產(型號:PE9600)。

1.3 研究方法 根據(jù)隨機數(shù)字表法分成5組,分別為模型組、正常組、陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組,每組各10只。除正常組外,其他各組小鼠在第1、8天時將0.2 ml混懸液(氫氧化鋁粉末1 mg+亂蛋白凍干粉0.2 mg)注入腹腔,當做首次致敏；在第15天將小鼠放置在超聲霧化器內,對小鼠噴灑1%的亂蛋白凍干粉生理鹽水以激發(fā)其發(fā)作哮喘,20 min/次,隔日1次,共激發(fā)10次。成功激發(fā)標志為小鼠出現(xiàn)站立不穩(wěn)或者點頭呼吸、口唇發(fā)紺、呼吸加快及腹肌痙攣等表征。依據(jù)人與動物劑量轉換,成功造模后陽性對照組小鼠灌胃劑量為0.5 mg/kg的地塞米松藥液,兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組分別灌胃劑量為1 mg/kg、2 mg/kg兒茶素藥液,模型組和正常組灌胃等劑量生理鹽水,每日1次,連續(xù)灌胃28 d。

1.4 觀察指標 (1)觀察小鼠一般情況,并稱取末次給藥后各組小鼠體質量。(2)稱重后小鼠腹腔注射劑量為0.8 ml/100 g的2.4%水合氯醛麻醉,剪開頸部毛發(fā)和皮膚,氣管周邊組織分離,作橫行切口,行氣管插管,將其右主支氣管結扎,生理鹽水灌洗左肺3次,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)回收后離心半徑8 cm,2 500 r/min離心10 min,棄掉上清液；選取沉渣重懸,吸取少許懸液放置在血細胞計數(shù)板下對細胞總數(shù)計數(shù)；BALF細胞涂片被Diff-Quik染色液染色后行分類細胞計數(shù),包含嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠BALF內IL-13、IL-5及IL-4含量,具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進行。(3)選取小鼠右支氣管平滑肌,緩沖液將沖洗,10%甲醛固定,而后行酒精梯度脫水、透明,石蠟包埋后切片,厚度為4μm,常規(guī)行HE染色,觀察其病理組織形態(tài)。(4)蛋白質免疫印跡檢測小鼠肺組織內p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表達,選取肺組織研磨,經過組織裂解后上樣電泳,起始電壓80 V,溴酚藍染料前緣進入到分離膠上緣后電壓提升到100 V,溴酚藍泳出分離膠下緣后電泳結束。半干電轉移儀于PVDF膜內行蛋白質電轉移,恒流為30 m A,連續(xù)90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST脫脂奶粉封閉,震蕩60 min。結束封閉后采用TNS-T漂洗液洗膜10 min,3次,把膜轉移到雜交袋內,加入適量漂洗液稀釋抗體,封口后在4℃下孵育過夜；TBST漂洗液洗膜10 min,3次,在加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗,震蕩60 min。PVDF膜放置在ECL顯色液內震蕩溫育5 min,暗室下曝光、顯影及定影。清水沖洗以后,晾干掃描,IPP軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。(5)檢測小鼠肺組織內p38MAPK、ERK m RNA表達,Trizol法提取小鼠右肺組織總RNA行RT-PCR擴增,p38MAPK正向引物:5'-GATTGAGATGATTTTGGAG-3',反向引物:5'-GTATGTTAAGTATATGATTG-3',擴增片段482 bp；ERK正向引物:5'-GCTCCAGGAATTCCTCGGTA-3',反向引物:5'-GAGTCCTGCATGCTAGCTAG-3',擴增片段389 bp；內參β-actin正向引物:5'-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3',反向引物:5'-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3',擴增片段482 bp。PCR反應條件:94℃45 s,55℃50 s,72℃75 s,在40次循環(huán)以后獲取p38MAPK、ERK m RNA循環(huán)閾值(Ct),使用ΔΔCt(ΔΔCt=Ct目的基因-ΔCt內參基因)分析,算出2-ΔΔCt目的基因相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示,采用方差分析進行數(shù)據(jù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般行為及體質量改變情況 正常組小鼠毛發(fā)光滑柔順,活動及飲食正常,無異常表征；模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)散亂、弓背直立、點頭呼吸、前肢縮抬及煩躁不安等表現(xiàn)；陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠癥狀比模型組明顯改善。

模型組小鼠體質量為(50.17±3.46)g,較正常組的(72.51±3.19)g降低；陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠體質量分別為(65.24±3.21)g、(64.82±3.37)g、(65.81±3.14)g,與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。

2.2 各組小鼠BALF內分類細胞及總細胞計數(shù)情況 與正常組比較,模型組小鼠BALF內嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及總細胞計數(shù)均顯著升高(P值均＜0.05)。與模型組比較,陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠BALF內嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及總細胞計數(shù)顯著降低(P值均＜0.05)。見表1。

2.3 各組小鼠BALF內IL-4、IL-5、IL-13水平情況 與正常組比較,模型組小鼠BALF內IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(P值均＜0.05)。與模型組比較,陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠BALF內IL-4、IL-5、IL-13水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。見表2。

2.4 各組小鼠支氣管平滑肌病理形態(tài)情況 正常組小鼠支氣管管壁完整,管腔內沒有上皮細胞脫落,平滑肌厚度正常,支氣管黏膜平整,無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠平滑肌變厚,支氣管壁內出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,主要為淋巴細胞與嗜酸粒細胞,管腔內分泌物變多,支氣管黏膜上皮發(fā)生脫落。陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠平滑肌厚度接近正常組,管腔中有少許脫落細胞與黏液,支氣管黏膜平整,有少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

表1 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液內分類細胞及總細胞計數(shù)情況(±s)

表1 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液內分類細胞及總細胞計數(shù)情況(±s)

注:與正常組比較,a P＜0.05；與模型組比較,b P＜0.05

組別 鼠數(shù) 嗜酸粒細胞(×106/ml)中性粒細胞(×106/ml)淋巴細胞(×106/ml)巨噬細胞(×106/ml)總細胞(×106/ml)正常組 10 0.07±0.02 3.14±1.08 4.09±1.39 10.69±2.37 19.48±3.67模型組 10 3.47±0.05a 12.69±1.64a 15.82±1.73a 24.99±2.16a 59.73±3.45a陽性對照組 10 1.14±0.04b 4.72±1.40b 8.26±1.60b 13.53±2.41b 28.47±3.16b兒茶素低劑量組 10 1.73±0.04b 5.96±1.58b 8.78±1.59b 13.94±2.46b 31.57±3.08b兒茶素高劑量組 10 1.52±0.05b 5.61±1.37b 8.21±1.42b 13.40±2.35b 30.68±3.25b F值 4.725 6.870 5.632 4.761 9.634 P值 0.016 0.002 0.009 0.017 0.001

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液內IL-4、IL-5、IL-13水平比較(±s)

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液內IL-4、IL-5、IL-13水平比較(±s)

注:與正常組比較,a P＜0.05；與模型組比較,b P＜0.05

組別 鼠數(shù)IL-13(ng/L)IL-5(ng/L)IL-4(ng/L)正常組 10 4.35±1.19 45.18±9.36 7.29±1.37模型組 10 17.64±1.82a 267.41±9.28a 21.08±1.94a陽性對照組 10 6.97±1.51b 89.71±9.13b 10.31±1.25b兒茶素低劑量組 10 7.36±1.50b 101.07±9.52b 11.76±1.42b兒茶素高劑量組 10 7.19±1.35b 98.75±9.40b 11.38±1.65b F值 7.821 16.824 10.034 P值 0.001 0.001 0.002

2.5 各組小鼠肺組織內p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表達情況 與正常組比較,模型組小鼠肺組織內p-p38MAPK、p-ERK蛋白表達均升高(P值均＜0.05)。與模型組比較,陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠肺組織內p-p38MAPK、p-ERK蛋白表達均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。見圖2、表3。

2.6 各組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK mRNA表達情況 與正常組比較,模型組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK m RNA表達均上升(P值均＜0.05)。與模型組比較,陽性對照組、兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK mRNA表達均降低(P值均＜0.05)。見表4。

圖2 小鼠肺組織內ERK、p-ERK、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表達電泳圖

表3 各組小鼠肺組織內p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表達(±s)

表3 各組小鼠肺組織內p-p38MAPK、ERK、p-ERK及p38MAPK蛋白表達(±s)

注:MAPK為絲裂原活化蛋白激酶；ERK為細胞外信號調節(jié)激酶；與正常組比較,a P＜0.05；與模型組比較,b P＜0.05

組別 鼠數(shù) p-p38MAPK ERK p38MAPK p-ERK正常組 10 0.42±0.05 0.98±0.09 1.49±0.17 0.15±0.03模型組 10 1.24±0.09a 1.03±0.12 1.44±0.15 0.31±0.05a陽性對照組 10 0.76±0.08b 0.87±0.10 1.48±0.16 0.16±0.04b兒茶素低劑量組 10 0.86±0.07b 0.86±0.11 1.52±0.17 0.19±0.05b兒茶素高劑量組 10 0.83±0.06b 0.87±0.10 1.51±0.16 0.17±0.05b F值 4.823 0.637 0.488 5.012 P值 0.014 0.416 0.213 0.010

表4 各組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK m RNA表達對比(±s)

表4 各組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK m RNA表達對比(±s)

注:MAPK為絲裂原活化蛋白激酶；ERK為細胞外信號調節(jié)激酶；與正常組比較,a P＜0.05；與模型組比較,b P＜0.05

組別 鼠數(shù) p38MAPK ERK正常組 10 0.08±0.03 0.03±0.01模型組 10 0.71±0.06a 0.42±0.03a陽性對照組 10 0.19±0.05b 0.17±0.02b兒茶素低劑量組 10 0.25±0.06b 0.24±0.03b兒茶素高劑量組 10 0.19±0.05b 0.16±0.03b F值 5.339 5.821 P值 0.006 0.003

3 討論

我國的中醫(yī)資源比較豐富,種類繁多。幾千年的中醫(yī)臨床驗證絕大多數(shù)的中藥不良反應較小,且安全性高。我國已有數(shù)千年的茶飲文化,當前茶葉為人們日常生活主要的保健品之一。兒茶素為黃烷醇類化合物,最早從茶葉內所提取,含黃酮類成分最大。相關研究顯示,兒茶素有抗炎與抗氧化等多種的藥理活性[6],有研究顯示,兒茶素對關節(jié)炎大鼠模型機體內炎癥反應有顯著抑制作用,降低腫瘤壞死因子α、IL-17及IL-1等炎性細胞含量,調節(jié)T淋巴細胞亞群內Th17/Treg平衡[7]。

過敏性哮喘為多種炎癥介質、細胞因子與炎癥細胞所參加氣道慢性炎癥性疾病,在哮喘患兒發(fā)病中氣道炎癥有重要影響,當前國內外診治哮喘方案都強調控制氣道炎癥。多種炎性細胞參與了氣道炎癥,包含嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞等。相關動物實驗顯示,BALF內有大量嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞存在,這些細胞活化為哮喘典型的特點[8]。哮喘誘導機體內免疫反應,導致嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞與巨噬細胞活化,同時向炎癥部位聚集、趨化,進而分解大量組胺、內皮素、白三烯及血小板活化因子等炎性介質,對氣道上皮細胞造成了間接或者直接損害,引發(fā)氣道炎癥。所以,嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞與巨噬細胞也是哮喘主要的炎癥效應細胞,為臨床診斷哮喘主要指標。本文研究顯示,模型組小鼠平滑肌變厚,支氣管壁內出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,主要為淋巴細胞與嗜酸粒細胞,管腔內分泌物變多,支氣管黏膜上皮發(fā)生脫落,說明造模成功。另外,與模型組比較,兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠BALF內嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及總細胞計數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義。同時小鼠肺組織平滑肌病理形態(tài)結果顯示,兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠平滑肌厚度接近正常組,管腔中有少許脫落細胞與黏液,支氣管黏膜平整,有少量炎癥細胞浸潤,說明兒茶素可使小鼠哮喘癥狀有效改善,抑制小鼠氣道炎癥反應。

MAPK為連接決定基因表達和細胞膜表層受體主要信號調節(jié)酶,MAPK信號轉導路徑為把細胞外信號導入細胞內的主要信號路徑。在機體炎癥反應內MAPK信號路徑有重要影響,主要包含p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶及ERK所介導三條級聯(lián)反應,激活上述路徑可加速形成炎癥細胞因子而使炎癥反應程度加重[9-12]。有研究顯示,上游特異性刺激分子雙磷酸化將ERK激活,而p-ERK活化后產生二聚體,由細胞質轉移至細胞核內,經過對一系列轉錄因子調控,導致炎癥反應[13]；p38MAPK為信號由細胞表層導入細胞核主要傳遞者,經過磷酸化轉錄因子對參加的細胞反應基因轉錄表達調節(jié)。p38MAPK介導形成炎癥因子與基因表達,對炎性細胞凋亡、分化與增殖調控,參與了慢性氣道疾病炎癥機制[14-15]。所以,在p38MAPK與ERK出現(xiàn)磷酸化后可將ERK/MAPK信號傳導路徑激活。同時有研究顯示,哮喘模型內ERK/MAPK信號路徑中相關蛋白活性變強[16]。本文研究顯示,與模型組比較,兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠肺組織內p-p38MAPK、p-ERK蛋白表達降低；與模型組比較,兒茶素低劑量組及兒茶素高劑量組小鼠肺組織內p38MAPK、ERK m RNA表達降低,差異有統(tǒng)計學意義,說明兒茶素可有效抑制小鼠機體內ERK/MAPK信號路徑激活。

綜上所述,兒茶素可使過敏性哮喘小鼠氣道內炎癥反應有效改善,其作用機制可能和抑制ERK/MAPK信號路徑激活有聯(lián)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突