非小細(xì)胞肺癌中Pokemon蛋白與P14ARF-MDM2-p53通路蛋白的相關(guān)性研究

王麗紅 竇亞平 韓雙雙 許浩然 王嘉

1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,石家莊050031;2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心,石家莊050031;3承德市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科067000

流行病學(xué)資料顯示,全球和中國的肺癌發(fā)病率和病死率均位居首位,嚴(yán)重威脅人類生命健康[1-2]。肺癌根據(jù)病理類型的不同,分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩大類。NSCLC主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等,占所有肺癌病理類型的85%[3]。目前認(rèn)為,肺癌的發(fā)病原因在于各種致癌因素引起細(xì)胞基因組DNA損傷、癌基因的激活以及抑癌基因的失活,是多基因、多因素相互作用的結(jié)果[4]。Pokemon基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄抑制因子POK家族成員之一,作為致癌劑促進(jìn)乳腺癌[5]、膀胱癌[6]及口腔鱗癌[7]等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。Agrawal等[8]研究推測,Pokemon通過調(diào)節(jié)P14ARF-MDM2-p53通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)病。當(dāng)前,NSCLC發(fā)病過程中,Pokemon和P14ARFMDM2-p53通路的作用及相互關(guān)系尚未明確,值得進(jìn)一步探討。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC中的Pokemon蛋白及P14ARF-MDM2-p53通路蛋白表達(dá)情況,分析各指標(biāo)間相關(guān)性及與臨床病理資料間的關(guān)系,為NSCLC的發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 一般資料 納入2015年10月至2016年10月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院行手術(shù)治療的35例NSCLC患者(術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療,均符合2011年第1版美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)非小細(xì)胞肺癌指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[9])為NSCLC組。其中,男26例,女9例；年齡(60.71±9.20)歲,年齡范圍為44～74歲；鱗狀細(xì)胞癌23例,腺癌12例；低中分化25例,高分化10例；伴有周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例,無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例；TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期23例,Ⅲ期和Ⅳ期12例。同時(shí),將癌旁正常支氣管斷端組織29例及肺炎組織25例分別作為支氣管對照組和肺泡對照組,全部組織標(biāo)本均由2位高年資病理主任醫(yī)師分別診斷證實(shí)。本研究獲得患者知情同意及河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2016026)。

1.2 主要試劑 兔多克隆抗體Pokemon和小鼠單克隆抗體MDM2、p53均購自英國Abcam公司,工作濃度分別為1∶200,1∶300,1∶300。兔多克隆抗體P14ARF購自沈陽萬類生物科技公司,工作濃度為1∶200。免疫組織化學(xué)染色試劑盒和濃縮型DAB試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法 檢測方法采用SP免疫組織化學(xué)法。常規(guī)石蠟包埋切片,將待檢測切片放入恒溫烤箱,60～65℃過夜,檸檬酸緩沖液煮沸修復(fù),嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書步驟進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。染色陽性判定以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒,其中以細(xì)胞核為著色部位的為MDM2和p53,以細(xì)胞質(zhì)為著色部位的是Pokemon、P14ARF。所有免疫組織化學(xué)結(jié)果均設(shè)立陰性與陽性內(nèi)對照。所有結(jié)果判定均由2位高年資病理主任醫(yī)師分別獨(dú)立完成,陽性判定以陽性細(xì)胞數(shù)占所觀察細(xì)胞總數(shù)百分比及染色強(qiáng)度綜合計(jì)算,陽性細(xì)胞數(shù)占所觀察細(xì)胞總數(shù)百分比:＜5%為0分,≥5%且＜25%為1分,≥25%且＜50%為2分,≥50%為3分；染色強(qiáng)度:不著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。每張病理切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野,兩項(xiàng)評(píng)分相加,≤3分判定為陰性,＞3分判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)；分析臨床病理資料時(shí)因n＜40,結(jié)果采用Fisher確切概率法；相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pokemon蛋白及P14ARF-MDM2-p53通路蛋白在3組間表達(dá)情況 Pokemon蛋白、MDM2蛋白、p53蛋白在NSCLC組中的表達(dá)均顯著高于肺泡對照組和支氣管對照組(χ2=32.93、25.93、22.98,P值均＜0.01),P14ARF蛋白在NSCLC組中的表達(dá)顯著低于肺泡對照組和支氣管對照組(χ2=25.39,P＜0.01),見表1、圖1～4。

2.2 NSCLC組中Pokemon、P14ARF、MDM2和p53蛋白的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系Pokemon和P14ARF蛋白表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均無關(guān)(P值均＞0.05)。NSCLC組中MDM2和p53蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān),其在肺癌低中分化的陽性表達(dá)顯著高于高分化(P=0.03、0.02),而與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均無關(guān)(P值均＞0.05),見表2。

2.3 Pokemon蛋白與P14ARF-MDM2-p53通路蛋白的相關(guān)性 在NSCLC組中,Pokemon與P14ARF蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.58,P＜0.01),P14ARF與MDM2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.51,P＜0.01),MDM2與p53蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.86,P＜0.01)。

3 討論

人類原癌基因Pokemon為POK紅系髓性致癌劑,定位于19p13.3,全長為21.6 kb,位于多種原癌基因和抑癌基因的上游,在基因轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用[10-11]。P14ARF基因位于9p染色體短臂上的CDKN2a位點(diǎn),由3個(gè)外顯子構(gòu)成,是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞周期的抑癌基因,編碼P14ARF蛋白[10]。原癌基因MDM2定位于12號(hào)染色體,編碼的MDM2蛋白能擾亂細(xì)胞周期的調(diào)控,影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12-13]。p53位于17號(hào)染色體,其基因產(chǎn)物有野生型和突變型2種,野生型p53發(fā)揮抑癌作用,而突變型p53具有促癌作用[14]。MDM2與p53的變化具有一定的同向性,高水平的p53-MDM2復(fù)合物具有較強(qiáng)的致癌活性,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。文獻(xiàn)報(bào)道,Pokemon可直接結(jié)合P14ARF啟動(dòng)子抑制其轉(zhuǎn)錄活性、激活P14ARF-MDM2-p53通路,在一些腫瘤中發(fā)揮致癌劑的作用[10,17]。

鱗狀細(xì)胞癌和腺癌是NSCLC的2種主要病理類型,發(fā)生于支氣管黏膜上皮、腺體和肺泡上皮,由于腫瘤的起源不同,可能存在著不同的癌變機(jī)制。本研究NSCLC組中包括鱗癌和腺癌,故特設(shè)支氣管對照組和肺泡對照組分析Pokemon、P14ARF、MDM2和p53蛋白在組間的表達(dá)情況,以增加試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究結(jié)果示Pokemon蛋白表達(dá)在NSCLC組中顯著高于支氣管對照組和肺泡對照組(P＜0.01),表明Pokemon蛋白在NSCLC發(fā)病過程中起致癌劑的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道,Pokemon在乳腺癌[5]、腎癌[18]、前列腺癌[19]、結(jié)直腸癌[17]等腫瘤中高表達(dá),結(jié)合本研究結(jié)果表明Pokemon在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn),Pokemon的表達(dá)水平與NSCLC TNM分期有關(guān)。姜海斌等[21]研究表明,Pokemon蛋白表達(dá)與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均明顯相關(guān)。本研究結(jié)果示Pokemon蛋白與NSCLC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有表達(dá)差異趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與前述兩項(xiàng)文獻(xiàn)結(jié)果不符,分析原因可能為本組樣本量小有關(guān),后期會(huì)加大樣本量進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)P14ARF蛋白在NSCLC組中低表達(dá),MDM2與p53蛋白在NSCLC組中高表達(dá),與支氣管對照組和肺泡對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明在NSCLC中P14ARF蛋白起抑癌作用,MDM2與p53蛋白發(fā)揮促癌作用。Seo等[22]和Li等[23]的研究表明,P14ARF蛋白可直接結(jié)合MDM2并抑制其對p53的降解,從而誘導(dǎo)G1期和G2期限制點(diǎn)的停頓；當(dāng)關(guān)閉p53-MDM2負(fù)反饋環(huán)路,直接抑制MDM2轉(zhuǎn)錄,使得p53迅速積聚,啟動(dòng)基因的修復(fù)和細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果推測,在NSCLC的發(fā)病過程中,P14ARF-MDM2-p53通路可能通過上述機(jī)制發(fā)揮作用。分析臨床病理資料發(fā)現(xiàn),MDM2和p53與NSCLC的腫瘤分化程度密切相關(guān),二者蛋白在低中分化組陽性表達(dá)均顯著高于高分化組(P值均＜0.05),提示MDM2和p53對NSCLC的預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義。Dong等[24]認(rèn)為,MDM2過度表達(dá)與胰腺腫瘤細(xì)胞分化程度有關(guān),與本研究結(jié)果相近。

表1 3組中Pokemon蛋白、P14ARF蛋白、MDM2蛋白、p53蛋白的表達(dá)[例(%)]

表2 Pokemon蛋白、P14ARF蛋白、MDM2蛋白和p53蛋白與臨床病理資料之間的關(guān)系[例(%)]

相關(guān)性分析結(jié)果示NSCLC組中Pokemon蛋白與P14ARF蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,P14ARF蛋白與MDM 2蛋白呈負(fù)相關(guān)性,MDM 2蛋白與p53蛋白呈正相關(guān)性,提示在NSCLC發(fā)病過程中,Pokemon可負(fù)向調(diào)節(jié)P14ARF蛋白表達(dá),推測其通過P14ARF-MDM2-p53通路發(fā)揮致癌作用。文獻(xiàn)報(bào)道,Pokemon可特異地結(jié)合于P14ARF啟動(dòng)子區(qū)域,是P14ARF的特異阻遏物,而P14ARF直接結(jié)合MDM2,進(jìn)而參與p53途徑影響淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展[10],間接佐證了本研究結(jié)論。

圖1 Pokemon蛋白在不同肺癌組織中的表達(dá) SP法 A:肺鱗癌Pokemon蛋白陽性 ×200；B:肺鱗癌Pokemon蛋白陽性 ×400；C:肺腺癌Pokemon蛋白陽性 ×200；D:肺腺癌Pokemon蛋白陽性 ×400

圖2 P14ARF蛋白在不同肺癌組織中的表達(dá) SP法 A:肺鱗癌P14ARF蛋白陽性 ×200；B:肺鱗癌P14ARF蛋白陽性 ×400；C:肺腺癌P14ARF蛋白陽性 ×200；D:肺腺癌P14ARF蛋白陽性 ×400

圖3 MDM2蛋白在不同肺癌組織中的表達(dá) SP法 A:肺鱗癌MDM2蛋白陽性 ×200；B:肺鱗癌MDM2蛋白陽性 ×400；C:肺腺癌MDM2蛋白陽性 ×200；D:肺腺癌MDM2蛋白陽性 ×400

圖4 p53蛋白在不同肺癌組織中的表達(dá) SP法 A:肺鱗癌p53蛋白陽性 ×200；B:肺鱗癌p53蛋白陽性 ×400；C:肺腺癌p53蛋白陽性 ×200；D:肺腺癌p53蛋白陽性 ×400

綜上所述,P14ARF-MDM2-p53通路在NSCLC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,Pokemon通過調(diào)節(jié)該通路蛋白表達(dá)而發(fā)揮促癌作用。以上結(jié)論可為NSCLC的發(fā)病機(jī)制研究提供新依據(jù),值得深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突