三重基序家族蛋白在肺腺癌患者中的表達(dá)及其診斷意義

陳海斌 黎一山 武宇航 楊峰 麥惠強(qiáng) 李姝君

1中山市人民醫(yī)院急診科528403;2中山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科528403;3中山市人民醫(yī)院骨二科528403;4廣州呼吸疾病健康研究院呼吸內(nèi)科510120;5廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤一區(qū),湛江524001

原發(fā)性肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,2014年我國發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示肺癌的新發(fā)病例居于惡性腫瘤首位[1]。在過去幾十年,肺鱗癌是肺癌的主要組織學(xué)類型；近年來,隨著環(huán)境的變化及吸煙人群結(jié)構(gòu)的改變,肺腺癌發(fā)病率和病死率逐年升高[2]。三重基序家族蛋白72(tripartite motif family protein 72,TRIM72)是一種泛素連接酶,2013年《Nature》雜志報(bào)道TRIM72能誘導(dǎo)胰島素抵抗引起代謝綜合征[3],因此陸續(xù)有文章研究其與糖尿病的關(guān)系。2017年國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在肝癌的遷移和侵襲中扮演著重要角色,有望成為肝癌基因治療的重要靶點(diǎn)[4]。2018年國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌患者組織和血清中表達(dá)降低,且可以作為結(jié)腸腫瘤的診斷中起著重要作用[5]。最新體內(nèi)試驗(yàn)顯示抑制肺泡巨噬細(xì)胞TRIM72的表達(dá)可減輕肺部重癥細(xì)菌感染[6]；既往也有文獻(xiàn)提示TRIM72在肺部氣道上皮細(xì)胞的損傷模型中起著保護(hù)作用[7-8],但其在肺部腫瘤中的表達(dá)尚未見報(bào)道。因此,本研究檢測(cè)TRIM72在肺腺癌組織及外周血血清、胸腔積液中的表達(dá),探索其與肺腺癌之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年8月至2018年2月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、心胸外科和腫瘤科經(jīng)電子支氣管鏡、改良性胸膜活檢術(shù)、經(jīng)皮CT引導(dǎo)下穿刺活檢、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)活檢或手術(shù)確診的肺腺癌80例。其中,男45例,女35例；年齡(54.08±13.19)歲,年齡范圍為22～75歲。以同時(shí)段20例健康體檢者為對(duì)照組。留取39例肺腺癌伴胸腔積液患者及同時(shí)段15例炎性胸腔積液患者胸腔積液以檢測(cè)胸腔積液TRIM72水平。肺腺癌病理診斷由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家確診,診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分類標(biāo)準(zhǔn)[9]及2015版WHO腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[10]。肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)參考2009年肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版)。本研究通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(42378904),本研究還獲得所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集 記錄年齡、性別、腫瘤TNM分期、臨床分期等資料。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 所有組織標(biāo)本均使用10%甲醛固定后,梯度脫水并石蠟包埋后進(jìn)行組織切片。組織切片經(jīng)60℃烘箱烘烤3 h后,進(jìn)行脫蠟與梯度乙醇水化,3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,在95～99℃下水浴抗原修復(fù),恢復(fù)至室溫后,使用BSA封閉20 min,滴加TRIM72抗體(上海艾博抗貿(mào)易有限公司)后4℃孵育過夜,PBS洗滌,加辣根化氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育40 min,PBS洗滌,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為TRIM72陽性。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 采用TRIM72 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海鑫樂生物公司),按照說明書操作。使用ELISA Calc軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合模型選用Logistic曲線(四參數(shù))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Graphpad Prism 6.0進(jìn)行圖形制作,Adobe Illustrator CS進(jìn)行圖片修飾。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s描述,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以M(QR)描述。計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較組間差異。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyU比較組間差異,采用Spearman相關(guān)確定數(shù)據(jù)相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM72在肺腺癌組織中的表達(dá) TRIM72主要在正常肺組織中表達(dá),而在肺腺癌癌旁氣道組織中表達(dá)微弱,肺腺癌組織的間質(zhì)中不表達(dá)(圖1)。

2.2 TRIM72在肺腺癌患者外周血、胸腔積液中的表達(dá) 在外周血中肺腺組TRIM72水平較健康對(duì)照組低,癌性胸腔積液TRIM72水平明顯低于炎性胸腔積液,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.73、10.09,P值均＜0.05),此外,肺腺癌患者外周血CEA、CA125水平高于對(duì)照組,癌性胸腔積液CEA、CA125水平高于炎性積液(P值均＜0.05),見圖2。

2.3 臨床資料及相關(guān)性分析 以血清TRIM72是否大于29.12 ng/L作為臨界值進(jìn)行臨床信息比較[4]。對(duì)2組患者各個(gè)指標(biāo)的分布進(jìn)行卡方分析,發(fā)現(xiàn)2組患者在年齡、原發(fā)腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平方面比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。分別對(duì)TRIM72與以上指標(biāo)進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析,TRIM72水平與年齡、原發(fā)腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期均無相關(guān)性(P值均＞0.05),而與CEA呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.556,P＜0.001)。此外,TRIM72水平對(duì)性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分化程度、CA125水平的分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.4 受試者工作特征曲線(receiver operating characteristics curve,ROC) 采用血清TRIM72、CEA、CA125等指標(biāo)單獨(dú)對(duì)肺腺癌診斷做ROC曲線,TRIM72低于110.629 ng/L、CEA高于4.535μg/L、CA125高于33.925 U/ml可分別作為診斷肺腺癌的cut-off值,曲線下面積分別為0.827、0.746、0.651,特異度及敏感度見表2。使用TRIM72分別聯(lián)合CEA、CA125等指標(biāo)做受試者工作曲線,曲線下面積明顯升高(表3)。其中TRIM72同時(shí)聯(lián)合CEA及CA125曲線下面積可達(dá)到0.934。

圖1 TRIM72在不同組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)法 ×200 A:正常氣道組織；B:癌旁氣道組織；C:肺腺癌組織

圖2 TRIM72、CEA、CA125在肺腺癌患者外周血、胸腔積液中的表達(dá)

表1 不同水平外周血TRIM72的肺腺癌患者的臨床特征[ng/L,例(%)]

表2 TRIM72、CEA及CA125診斷肺腺癌的AUC與cut-off值

表3 TRIM72與CEA、CA125聯(lián)合診斷肺腺癌的AUC

3 討論

肺癌是我國病死率和死因居于首位的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害人類健康。近二十年來,肺腺癌的發(fā)病率逐年升高。肺癌起病隱匿,大多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期。同時(shí),因肺腺癌組織內(nèi)血管豐富,淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移早,進(jìn)展快,導(dǎo)致預(yù)后不佳。因此尋找理想的腫瘤標(biāo)記物用于診斷、治療將有較高的臨床價(jià)值。

TRIM72又稱MG53,是由144個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為53 000的一個(gè)小分子蛋白。TRIM72由一個(gè)指環(huán)結(jié)構(gòu),一個(gè)B-Box和一個(gè)卷曲螺旋組成[11]。TRIM72是三基序蛋白家族成員之一,TRIM蛋白家族結(jié)構(gòu)保守,進(jìn)化較快,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過70種家族成員,且多個(gè)家族成員與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[12]。目前國內(nèi)外關(guān)于TRIM72研究較少,已有的研究表明TRIM72能促使受損肌細(xì)胞膜的修復(fù)[13],調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞,對(duì)心肌有保護(hù)功能[14]。近年研究發(fā)現(xiàn),TRIM72能誘導(dǎo)胰島素抵抗及代謝綜合征[3]。TRIM72可以直接或間接地調(diào)節(jié)胞腔內(nèi)吞,通過去除質(zhì)膜創(chuàng)傷參與肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)[15]。2018年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)吸入TRIM72可以減輕肺部通氣損傷[16],另外有國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)TRIM72在結(jié)腸癌的診斷中起著重要作用,TRIM72明顯降低可提示結(jié)腸腫瘤的發(fā)生[5]；而結(jié)腸癌最常見的組織類型就是腺癌。因此,我們推測(cè)TRIM72可能與結(jié)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

本研究首先使用組織切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示TRIM72在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織,主要在癌旁氣道上皮組織間質(zhì)中表達(dá),而在肺腺癌組織中不表達(dá)；這提示TRIM72在正常組織中起著保護(hù)性作用,而在腫瘤組織中TRIM72受到微環(huán)境的抑制而表達(dá)下調(diào),該結(jié)果與既往研究TRIM72在結(jié)腸腫瘤得出結(jié)論相似[5],這提示TRIM72可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮作用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),TRIM72可以調(diào)節(jié)大鼠心肌纖維細(xì)胞的增殖和遷移[17],在外周血血清中可作為心肌損傷標(biāo)志物[18],說明TRIM72可分泌到外周血中進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。因此,我們收集健康人與肺腺癌患者外周血血清檢測(cè)TRIM72水平,發(fā)現(xiàn)在外周血血清中,肺腺癌患者TRIM72水平低于健康人且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。參考既往文獻(xiàn)[4],本研究采用TRIM72是否高于29.12 ng/L對(duì)臨床資料分析。TRIM72水平與肺腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),且TRIM72在正常氣道上皮組織或癌旁氣道上皮組織間質(zhì)中表達(dá),結(jié)合既往文獻(xiàn)認(rèn)為TRIM72在肺氣道上皮損傷中起著保護(hù)作用[7,13,16],我們推測(cè)TRIM72在正常組織中起著保護(hù)作用,而在腫瘤微環(huán)境中由間質(zhì)細(xì)胞分泌,表達(dá)明顯減少,與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí),TRIM72水平與肺腺癌患者的年齡、原發(fā)腫瘤大小、臨床分期及CEA水平存在相關(guān)性,而與性別、分化程度、CA125水平無相關(guān)性,這也提示了TRIM72在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著一定角色。

在過去的幾十年,關(guān)于腫瘤生物標(biāo)記物的探索一直在進(jìn)行著,然而針對(duì)肺癌的生物標(biāo)記物其特異度及敏感度仍未能同時(shí)兼顧。本研究發(fā)現(xiàn)TRIM72水平降低與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān),因此,我們推斷血清TRIM72是否可以作為肺腺癌的腫瘤標(biāo)記物用于臨床診斷。使用各指標(biāo)單獨(dú)做ROC曲線,發(fā)現(xiàn)外周血TRIM72低于110.629 ng/L可提示肺腺癌的發(fā)生,曲線下面積達(dá)到0.827。而外周血CEA高于4.535μg/L、CA125高于33.965 U/ml曲線下面積分別只有0.746和0.651。TRIM72聯(lián)合CEA、CA125的ROC曲線下面積可達(dá)到0.934,這些數(shù)據(jù)表明TRIM72可能成為肺腺癌的新的腫瘤標(biāo)志物。本研究顯示TRIM72主要表達(dá)在正常氣道上皮組織及間質(zhì)中,而在腫瘤組織中表達(dá)降低或缺失；同樣在健康人外周血血清中TRIM72水平明顯高于肺腺癌患者,且TRIM72水平與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分期及CEA水平相關(guān)。綜上所述,我們認(rèn)為TRIM72可能作為肺腺癌診斷的生物標(biāo)記物,與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)；其可能在腫瘤中作為負(fù)向調(diào)控因子存在,且與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。但具體機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究得以明確。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突