光譜技術(shù)在甘藍型油菜品質(zhì)檢測中的研究進展

盧俊瑋，田容才，花宇輝，官春云*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

高油酸油菜（Brassica napusL.）是指種子在低芥酸的基礎(chǔ)上油酸含量提高至75%以上的油菜，因其菜籽油是良好的可促進人體心血管健康的家庭烹調(diào)原料,且可作為生物柴油原料，故已成為當(dāng)前油菜育種的熱點方向。高油酸油菜育種工作始于20世紀(jì)90年代，而國內(nèi)起步較晚，始于21世紀(jì)初。目前已認定的高油酸油菜品種有湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的‘高油酸 1 號’（High oleic 1）、‘帆鳴 1 號’（Fanming 1）以及浙江省農(nóng)科院培育的‘浙油 80’（Zheyou 80）等幾個品種，育種研究進展緩慢。創(chuàng)制高油酸油菜材料是加快高油酸油菜育種的關(guān)鍵。目前創(chuàng)制作物種植資源的方法較多，包括雜交育種、化學(xué)誘變、物理誘變、基因工程、分子標(biāo)記輔助選擇、航天誘變等，但所有這些方法在對其后代材料篩選中均存在周期長、工作量大等顯著弊端。因此，找尋快速、無損、準(zhǔn)確的早期鑒定方法對加快高油酸油菜育種進程具有重要的意義。

光是具有波粒二象性的電磁波，不同的地物對電磁波有不同的反射、透射、吸收和散射特性。光譜技術(shù)依據(jù)地物在電磁波上的差異性進行對象探測，其基本原理是通過借助光學(xué)儀器獲取地物在特定光譜域的光譜曲線，利用其波譜信息表達目標(biāo)物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，從而判別目標(biāo)物的特定屬性[1]。因此，光譜技術(shù)具有空間分辨率和光譜分辨率的特點。光譜技術(shù)根據(jù)不同的研究尺度和光譜設(shè)備搭載平臺的差異，分為衛(wèi)星遙感技術(shù)、無人機遙感技術(shù)和地面遙感技術(shù)[2]。根據(jù)面向?qū)ο蟮牟町愡€可細分為生態(tài)、種群、個體、器官、組織和細胞等領(lǐng)域技術(shù)。一般而言，高度越高則分辨率越低，尺度越大，粗糙度越高，且受環(huán)境影響更明顯。從光譜可視化方面可分為非成像光譜技術(shù)和成像光譜技術(shù)。根據(jù)光譜波段數(shù)量可分為多光譜技術(shù)、高光譜技術(shù)和超光譜技術(shù)，波段數(shù)越多則波段寬度越窄，地物信息越容易區(qū)分和識別。根據(jù)不同波段范圍可分為X射線技術(shù)[3]、紫外/可見光光譜技術(shù)[4]、可見/近紅外光譜技術(shù)[5]、紅外技術(shù)[6]、太赫茲技術(shù)[7]、核磁共振技術(shù)[8]、拉曼光譜技術(shù)[9]、熒光光譜技術(shù)[10]、激光誘導(dǎo)擊穿光譜[11]等。光譜技術(shù)作為數(shù)字農(nóng)業(yè)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于水稻、油菜、小麥、玉米、棉花等農(nóng)作物的高通量表型數(shù)據(jù)采集中，可實現(xiàn)農(nóng)作物的快速無損大面積長勢監(jiān)測、產(chǎn)量與品質(zhì)預(yù)測及病蟲害預(yù)警預(yù)測等，推動了我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進程。

1 甘藍型油菜的品質(zhì)性狀與生物學(xué)基礎(chǔ)

1.1 營養(yǎng)器官與品質(zhì)性狀

籽粒的油酸含量明顯受不同生育期的營養(yǎng)器官的光合影響，其油酸含量與營養(yǎng)器官中的油酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)。冷鎖虎等[12]指出，籽粒的灌漿物質(zhì)中有2/3來自于成熟期角果的光合產(chǎn)物，而直接來自于葉片的光合產(chǎn)物不足10%。李俊[13]指出，蕾薹期的光合速率對品質(zhì)相關(guān)性狀影響較大，其含油量、油酸、亞油酸和蛋白等與蕾薹期光合速率的相關(guān)性顯著。陳婷[14]研究發(fā)現(xiàn)，初花期對不同葉位的葉片進行摘葉處理，均會導(dǎo)致單株籽粒產(chǎn)量和含油量的降低。該研究同時還發(fā)現(xiàn)：摘除短柄葉會增加籽粒的蛋白質(zhì)含量；摘除無柄葉會減少籽粒的芥酸含量,且顯著增加其棕櫚酸含量；而終花期摘除葉片對籽粒含油量、蛋白質(zhì)含量和脂肪酸各組分含量均無顯著影響。Rood等[15]研究發(fā)現(xiàn)，終花期下部葉片（主要為長柄葉和部分短柄葉）的光合產(chǎn)物向角果和種子擴散較少，而上部葉片（主要為無柄葉和部分短柄葉）則與之相反。終花期后對油菜角果進行遮光處理，可增加籽粒中的飽和脂肪酸含量、降低其不飽和脂肪酸含量，而摘除葉片及對葉片進行遮光處理，可促進籽粒中不飽和脂肪酸的積累，但其中油酸含量均未受到顯著影響[16]。官梅等[17]通過對高油酸油菜和普通油菜的種子與花期上部功能葉的脂肪酸進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著種子油酸含量的提高，高油酸油菜的葉片油酸含量也相應(yīng)提高。高建芹等[18]研究表明，種子的油酸含量與各生育期營養(yǎng)器官中的油酸含量均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，其中蕾薹期葉片中的油酸含量最高，花期葉片次之，而成熟期根、莖中的油酸含量最高。

1.2 成分構(gòu)成與品質(zhì)性狀

由于質(zhì)膜和脂肪的生物合成具有共同途徑，因此脂肪積累會受到制約[19]。脂肪酸是質(zhì)膜中磷脂和糖基甘油脂的重要組成成分，其中磷酸是由2個脂肪酸和甘油共價結(jié)合形成的脂類，且包含油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸[20]。種子中的脂肪是脂肪酸的三酰甘油，以油體的形式存在于細胞質(zhì)中，含量一般為種子干重的30%～50%[21]。脂肪酸的組成與含油量之間存在密切的相互關(guān)系，而油酸含量與含油量之間相關(guān)性則存在一定的爭議。袁姜蓮[22]將521份甘藍型油菜材料種植在不同環(huán)境下，研究結(jié)果表明,含油量與花生烯酸含量呈極顯著或顯著正相關(guān)，與蛋白質(zhì)、棕櫚酸、硫苷和亞油酸的含量均呈顯著或極顯著負相關(guān)。官梅等[23]對高油酸（80%以上）、中油酸（60%左右）和低油酸（30%以下）各取2份材料進行了研究，發(fā)現(xiàn)高油酸菜籽油中除含有高油酸外，還含有亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸以及少量花生烯酸；相對于高油酸材料而言，中油酸材料中含有較高的亞油酸，而低油酸材料中長鏈脂肪酸花生烯酸和芥酸的含量較高。楊柳等[24]通過對5 677個油菜自交種子的脂肪酸成分進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)油酸與硬脂酸外的其他脂肪酸基本上呈極顯著負相關(guān)。王曉丹等[25]對20個甘藍型高油酸油菜品系的不同脂肪酸成分進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)油酸含量與亞油酸、亞麻酸含量均呈極顯著負相關(guān)，亞油酸、亞麻酸和棕櫚酸之間兩兩呈顯著或極顯著正相關(guān)。由于油酸、亞油酸和亞麻酸都是硬脂酸連續(xù)脫飽和的代謝途徑的產(chǎn)物[26]，因此幾個性狀之間均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)性。

1.3 農(nóng)藝措施與品質(zhì)性狀

油菜脂肪酸含量既受主基因控制，也受修飾基因影響[25]。雖然油酸遺傳特性是由多個主效基因控制，在不同環(huán)境下高油酸性狀仍能穩(wěn)定表達，但農(nóng)業(yè)措施會對其油酸含量產(chǎn)生一定的影響。合理配方施肥或緩釋施肥技術(shù)均有利于油菜油酸含量的提高，油菜的油酸含量隨著施肥量和種植密度的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。氮肥施用量與油酸含量呈負相關(guān)；硫、磷、鉀、硼肥施用量與油酸含量呈正相關(guān)，與亞油酸、亞麻酸和芥酸的含量呈負相關(guān)。李志玉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，施氮肥降低了硫甙和芥酸的含量，提高了油酸含量。朱洪勛等[28]認為：施氮增加了粗蛋白含量，降低了粗脂肪含量；施磷、鉀肥提高了油酸和亞油酸的含量，降低了芥酸含量。不同播種方式下，油菜油酸含量總體表現(xiàn)為：翻耕直播＞免耕直播＞翻耕移栽＞免耕移栽[29]。油菜過遲收割導(dǎo)致脂肪和油酸的含量均有所下降[30]。

1.4 種植環(huán)境與品質(zhì)性狀

種子發(fā)育期間，較高的環(huán)境溫度下會形成較多的單不飽和脂肪酸，而較低的環(huán)境溫度下會形成更多的多不飽和脂肪酸，且油酸的合成對溫度敏感。角果期是影響油菜脂肪酸和含油量的關(guān)鍵時期，其次是花期和蕾薹期。在角果期，充足的光照和較高的有效積溫有利于棕櫚酸、油酸、亞油酸的合成與積累[31]。干旱脅迫會導(dǎo)致棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、花生烯酸等脂肪酸的含量上升，硬脂酸和油酸的含量下降[32]。漬水脅迫對油酸、亞油酸、亞麻酸的含量影響不顯著，含油量受害率相對明顯[33]。王毅等[34]通過對5個甘藍型春油菜品種在甘肅省具有代表性的地區(qū)進行種植研究，發(fā)現(xiàn)油酸受其影響極顯著，地區(qū)平均變異系數(shù)相對較小。

2 基于光譜技術(shù)的油菜品質(zhì)檢測

2.1 光譜技術(shù)的優(yōu)缺點

實驗室檢測脂肪酸組成的主要方法是基于氣相色譜法（gas chromatography，GC）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。GC可用來測定油菜等作物中的各類脂肪酸含量，具有檢測靈敏度高、分離度好、重復(fù)性佳、檢出限低等優(yōu)點，但在進行氣相色譜分析之前需要對所測樣品進行預(yù)處理；HPLC可以準(zhǔn)確、快速地定量、定性分析各類混合脂肪酸甘油酯和游離脂肪酸,雖檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但存在樣品小、數(shù)量少、操作過程繁瑣、耗時、有損及非專業(yè)人員不能勝任等諸多弊端[35]。光譜技術(shù)的快速發(fā)展為油菜品質(zhì)的高通量、無損檢測提供了新的途徑。其工作原理是使用光譜類儀器采集油菜冠層、葉片或籽粒的光譜數(shù)據(jù)，再結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法與實測品質(zhì)指標(biāo)建立定量關(guān)系，以實現(xiàn)品質(zhì)指標(biāo)的估算或預(yù)測[35]。但是，光譜數(shù)據(jù)采集過程易受外部因素影響，導(dǎo)致數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度下降。胡新禮等[36]研究發(fā)現(xiàn)，氣溶膠混濁介質(zhì)引起的前向光散射會導(dǎo)致光譜圖像質(zhì)量降低。朱文秀等[37]探討了不同的樣品預(yù)處理方式對應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)測定油菜種子品質(zhì)指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，樣品量、樣品含水量、發(fā)霉率、芽粒率以及成熟度對品質(zhì)指標(biāo)含量的結(jié)果均有較大的影響。吳建國等[38]研究得出，在利用近紅外反射光譜構(gòu)建油菜籽粒脂肪酸成分分析模型時，以8 g的樣品量建立的校正模型效果最好，6種脂肪酸的校正決定系數(shù)為0.74～0.98。故外部因素造成的數(shù)據(jù)質(zhì)量問題是可以通過優(yōu)化模型和統(tǒng)計方法進行修正的。目前，基于光譜技術(shù)的油菜籽粒含油量和脂肪酸成分等品質(zhì)指標(biāo)檢測方面具有較多研究。尤其在大田高通量的無損品質(zhì)檢測中，廣泛應(yīng)用的光譜技術(shù)是衛(wèi)星遙感技術(shù)、無人機遙感技術(shù)、葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)、可見光/近紅外技術(shù)等。

2.2 脂肪酸成分檢測

平衡各種脂肪酸水平是油菜品質(zhì)改良面臨的重要問題[39]，而低芥酸、低亞麻酸、高油酸和高亞油酸又是應(yīng)對油菜營養(yǎng)品質(zhì)要求的脂肪酸組分改良目標(biāo)[40]。基于光譜技術(shù)的油菜脂肪酸成分的快速無損檢測有助于加速油菜品質(zhì)育種進程。程潛等[41]采用ASD FieldSpec Pro FR 2500地物光譜儀測定了3個甘藍型油菜盛花期的冠層光譜，并與其成熟籽粒的棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸組分進行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)各品系油菜以一階微分光譜建立的差值植被指數(shù)（difference vegetation index，DVI）與各脂肪酸的相關(guān)系數(shù)均達到極顯著差異水平，其中492、792 nm可作為甘藍型油菜油酸估測的敏感波長。李施蒙等[42]對169份油酸含量在60%～80%的高油酸甘藍型油菜材料進行了近紅外光譜掃描，采用分段建模的方法構(gòu)建了其脂肪酸成分的近紅外分析模型，所建立的模型對油酸、亞油酸和亞麻酸的檢測效果較好，定標(biāo)相關(guān)系數(shù)（regressionsquared，RSQ）在0.90左右，因此該方法所建模型可用于高油酸育種早期材料的快速篩選。楊翠玲等[43]對比分析了紙層析法和近紅外光譜技術(shù)用于油菜籽粒芥酸品質(zhì)分析的效果，發(fā)現(xiàn)將掃描次數(shù)設(shè)定為128次，分辨率為4 cm-1時，建立的模型效果最優(yōu),決定系數(shù)（R2）為0.79，可用于品質(zhì)育種中早期材料的篩選。

2.3 含油量檢測

含油量不僅是油菜重要的農(nóng)藝性狀，還是評價油菜品質(zhì)的關(guān)鍵決定因素[44]。提高油菜種子含油量是育種目標(biāo)之一，但育種材料的篩選周期長這一問題嚴重制約著新品種的培育。胡慶一等[45]對3個不同含油量的甘藍型油菜近等基因系菜籽的反射光譜進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同含油量油菜種子間的光譜存在差異。常濤等[5]采集了不同含油量甘藍型油菜材料的生育期冠層反射光譜和葉片葉綠素含量數(shù)據(jù)，并與實測種子含油量進行了分析，發(fā)現(xiàn)幼苗期葉綠素含量與含油量呈顯著正相關(guān)，490、560、670 nm的光譜反射率與含油量呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均達-0.90以上，因此幼苗期可進行含油量預(yù)測，為高含油量油菜種質(zhì)資源的早期篩選提供了方法。Petisco等[46]對不同含油量甘藍型油菜和芥菜型油菜可見/近紅外光譜的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法進行了研究，得出以二階微分預(yù)處理的效果最好，且對籽粒含油量估測所得決定系數(shù)（R2）為0.98。熊思等[47]研究發(fā)現(xiàn)，不同含油量甘藍型油菜近等基因系材料在不同生育時期的葉片反射光譜中存在差異，可作為高油油菜材料生育前期篩選的依據(jù)。姚平等[11]使用激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)對5個油菜品種籽粒含油量進行了估測，發(fā)現(xiàn)388.2 nm譜線可作為油菜籽含油量分析的定標(biāo)曲線。

2.4 硫苷檢測

雖然“雙低”油菜已經(jīng)得到大范圍的推廣種植，但育成的雙低油菜品種的抗逆性普遍較傳統(tǒng)雙高油菜差[48],高油酸品系葉片油酸含量提高，使得葉片中油酸減飽和能力降低，進而使α-亞麻酸減少，從而導(dǎo)致葉片抗病性降低[17]。因此在油菜種子硫苷含量降低的前提下，其他組織中硫苷的有效保留甚至提高成為了新一輪油菜的品質(zhì)育種目標(biāo)[49]。王耐紅等[50]通過采集266份甘藍型油菜籽的近紅外光譜數(shù)據(jù)與其實測硫苷組分的質(zhì)量摩爾濃度進行分析，并建立了檢測模型，得出該模型對2-羥基-3-丁烯基脫硫硫苷和3-丁烯基脫硫硫苷的檢測性能較好。Font等[51]采用改進的偏最小二乘回歸（modify partial least squares regression，MPLSR）法對基于近紅外光譜技術(shù)的油菜葉片中硫代葡萄糖苷組分的檢測效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)使用MPLSR法后檢測總硫苷時的決定系數(shù)為0.80。Sen等[52]以240份芥菜型油菜和193份甘藍型油菜種子為材料，研究其品質(zhì)指標(biāo)檢測的近紅外光譜校準(zhǔn)模型，得出模型外部驗證的RSQ均大于0.70，其中對這2種類型的油菜硫代葡萄糖苷檢測所得RSQ大于0.95。

3 總結(jié)與展望

3.1 技術(shù)應(yīng)用

研究表明，光譜技術(shù)已應(yīng)用于油菜生物量、生育期、葉部性狀、根系性狀、種子性狀、光合作用、產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、病蟲害抗性和非生物逆境抗性等研究領(lǐng)域。油菜油酸遺傳機理復(fù)雜，高油酸性狀既受顯性多基因控制，又受多個微效基因影響。油酸作為品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)，是栽培育種過程中重點觀測的數(shù)據(jù)之一。雜種優(yōu)勢的利用有利于高油酸的形成[53]。育種上將雜交優(yōu)勢的利用、基因芯片技術(shù)和航天育種等相互結(jié)合，利用高光譜技術(shù)在生長前期檢測營養(yǎng)器官中的油酸含量來預(yù)測和篩選高油酸材料，減少了花期選擇的盲目性，縮短了育種進程，從而輔助篩選高油酸油菜新種質(zhì)資源和不育系。

3.2 存在困難

近年來，基因組學(xué)與表型組學(xué)的交叉研究逐漸被關(guān)注，高通量測序、基因芯片、分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展使得基因型數(shù)據(jù)的獲取成本降低、周期變短、商業(yè)化程度提高。但是光譜特征能否高效、準(zhǔn)確地檢測油菜生理化指標(biāo)的可行性已成為制約交叉學(xué)科發(fā)展的瓶頸。光譜技術(shù)現(xiàn)階段的特點是光譜波段由疏到密，光譜分辨率由低到高，光譜數(shù)據(jù)由小到大。因此，在光譜數(shù)據(jù)應(yīng)用中常見的3類問題有：一是嚴重依賴硬件資源支撐數(shù)據(jù)處理問題；二是連續(xù)波段間的數(shù)據(jù)冗余問題；三是數(shù)據(jù)維數(shù)增加分類精度會降低的維數(shù)災(zāi)難問題。

3.3 發(fā)展趨勢

從硬件資源發(fā)展來看，隨著人工智能和云計算技術(shù)的飛速發(fā)展，硬件資源導(dǎo)致的上算力不足、處理周期長的困局正逐步化解。例如，此次新冠疫情期間，阿里云通過開放人工智能（artificial intelligence,AI）算力，將高精度的個人全基因組測序時間由120 h縮短至15 min。從數(shù)據(jù)處理方法來看，高光譜數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展是對冗余光譜特征的削減與有效光譜特征的提取，而多光譜數(shù)據(jù)處理方法并不適用于擁有較高數(shù)據(jù)維度和數(shù)據(jù)冗余的高光譜數(shù)據(jù)。當(dāng)前，經(jīng)驗?zāi)Ｐ褪亲畛Ｓ玫纳砘笜?biāo)量化方法，其中,基于線性模型進行特征選擇和提取應(yīng)用最為廣泛，而基于非線性模型的研究相對較少。光譜技術(shù)研究過程應(yīng)根據(jù)應(yīng)用目的、問題尺度、技術(shù)水平、數(shù)據(jù)獲取、時間成本以及預(yù)算限制等因素選擇或優(yōu)化特征選擇和信息提取方法，從而減小數(shù)據(jù)維數(shù)和冗余量。

以高光譜等為代表的數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為油菜生理化數(shù)據(jù)無損失、自動化、高通量采集提供了良好的解決途徑。光譜技術(shù)自身的發(fā)展和應(yīng)用可在育種和品質(zhì)檢測技術(shù)由半自動化向自動化轉(zhuǎn)化、外部品質(zhì)向內(nèi)部品質(zhì)轉(zhuǎn)化、文本化向可視化轉(zhuǎn)化、單項目檢測向綜合全方位轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。將不斷發(fā)展的光譜技術(shù)應(yīng)用到油菜栽培育種方面有利于提高油菜品質(zhì)檢測評價效率，降低檢測成本，縮短品種選育周期,提升資源篩選和育種效率。