質(zhì)譜技術(shù)在缺血性中風(fēng)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用及進(jìn)展

王健瑩，吳 茜，姚鐘平*

(1.香港理工大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)及藥物研發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食物安全及科技研究中心，應(yīng)用生物與化學(xué)科技學(xué)系，香港；2.香港理工大學(xué)深圳研究院 深圳市中藥藥學(xué)及分子藥理學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地)，深圳市食品生物污染與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057)

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病，具有高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。腦卒中包括出血性中風(fēng)(ICH)和缺血性中風(fēng)(IS)，其中，IS占比高達(dá)87%[1-2]。根據(jù)發(fā)病原因，IS又分為大動脈粥樣硬化性卒中、小動脈卒中、心源性腦栓塞以及未知病因IS。組織性纖溶酶原激活劑(rtPA)是目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的唯一用于急性IS溶栓的藥物，然而靜脈注射rtPA的最佳治療窗為發(fā)病后3 或 4.5 h內(nèi)，一旦錯過該黃金時間，不僅預(yù)后不佳，而且出血性轉(zhuǎn)化的概率大幅提高[2]。所以，IS的早期預(yù)防、診斷、治療以及預(yù)后的功能評估成為降低IS致死率和致殘率的關(guān)鍵。目前，腦梗死的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)及神經(jīng)影像技術(shù)，輔以神經(jīng)血管成像數(shù)據(jù)或計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、超聲檢查或血管造影。這些成像技術(shù)已被用于區(qū)分缺血性和出血性中風(fēng)，并排除卒中假象。對于急性缺血性卒中診斷，目前這些臨床常用方法因在靈敏度、準(zhǔn)確度及耗時方面尚存在不足[3]，有時會產(chǎn)生誤診或者漏診，從而可能導(dǎo)致治療延誤及增加復(fù)發(fā)中風(fēng)的風(fēng)險。尋找分子標(biāo)志物以快速且準(zhǔn)確診斷和區(qū)分缺血性中風(fēng)，是解決這些問題的有效方法。

質(zhì)譜技術(shù)不僅靈敏度高、分析速度快、無需標(biāo)記、可同時檢測多組分，還能獲得分子的結(jié)構(gòu)信息，在組學(xué)領(lǐng)域已逐漸成為主要分析手段。液相色譜-質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以在質(zhì)譜分析前進(jìn)行色譜分離，有助于生物樣本中復(fù)雜成分的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析，因此廣泛應(yīng)用于標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[4]。此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間質(zhì)譜成像技術(shù)可直接分析生物組織切片樣本，對組織中化合物的組成、相對豐度及分布情況進(jìn)行高通量、全面、快速分析，在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中具有廣泛的應(yīng)用。近年來，質(zhì)譜技術(shù)被越來越多的學(xué)者用以進(jìn)行腦梗死相關(guān)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，在腦梗死的超早期診斷、病因?qū)W分型、預(yù)后評估、鑒別診斷以及二級預(yù)防等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。與IS相關(guān)的分子標(biāo)志物主要為蛋白質(zhì)以及小分子代謝物，以下將對質(zhì)譜技術(shù)在這兩類標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述及展望。

1 蛋白質(zhì)標(biāo)志物

腦損傷發(fā)生后的腦細(xì)胞狀態(tài)與蛋白質(zhì)表達(dá)密切相關(guān)，因此蛋白質(zhì)標(biāo)志物篩選對中風(fēng)的快速診治有著積極、重要的作用，并且有些已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)[5-7]。近年來高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在評估神經(jīng)元損傷程度，研究藥物作用機(jī)制以及尋找關(guān)鍵蛋白標(biāo)志物等方面的作用日益明顯[7]?；谫|(zhì)譜分析的蛋白組學(xué)使得獲得高精度的大量譜學(xué)數(shù)據(jù)成為可能，在中風(fēng)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面有不可替代的優(yōu)勢。

1.1 缺血性中風(fēng)標(biāo)志物

與腦組織、腦脊液相比，血液或者血漿樣品中標(biāo)志物含量相對較低，但是因?yàn)榍秩胄孕?，容易獲取，并且直接與循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)而在臨床上有著重要的價值[7]。而血液標(biāo)志物在中風(fēng)的診斷、預(yù)測中風(fēng)后腦損傷程度、中風(fēng)復(fù)發(fā)以及愈后恢復(fù)進(jìn)展等方面都有一定相關(guān)性[9-10]。Allard等[11]將表面增強(qiáng)激光解析(SELDI)技術(shù)應(yīng)用于中風(fēng)標(biāo)志物研究，實(shí)驗(yàn)組血漿樣品強(qiáng)陰離子交換SELDI譜顯示4種蛋白可以作為潛在的標(biāo)志物，分別為載脂蛋白C1(ApoC-I)、載脂蛋白C-3(ApoC-Ⅲ)、血清淀粉樣蛋白與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析首次發(fā)現(xiàn)ApoC-I與ApoC-Ⅲ蛋白在缺血性中風(fēng)與出血性中風(fēng)患者間有顯著性差異。類似地，Lopez等[12]進(jìn)一步以選擇離子監(jiān)測(SIM)質(zhì)譜分析方法對臨床患者血漿樣本中一組9個載脂蛋白進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果表明，結(jié)合ApoC-Ⅲ與ApoC-I兩種蛋白血漿濃度值，可以很好地鑒定缺血性中風(fēng)與出血性中風(fēng)，為之前研究結(jié)果提供了很好的驗(yàn)證。George等[13]專注于短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)的研究，以高分辨線性軌道阱質(zhì)譜對TIA患者、小中風(fēng)患者與對照組別的血清蛋白質(zhì)組開展了分析，實(shí)驗(yàn)中血清銅藍(lán)蛋白、補(bǔ)體成分8γ(C8γ)與血小板堿性蛋白在中風(fēng)組與對照組間有顯著性差異，其中，血小板堿性蛋白被驗(yàn)證可以列為TIA診斷的候選標(biāo)志物。此外，在生物表型中有非常重要作用的金屬蛋白標(biāo)志物，亦具有區(qū)分中風(fēng)類別的能力。Kodali等[14]以電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測不同中風(fēng)類別的29個血漿樣品，發(fā)現(xiàn)鎂、錳、銅、硒相關(guān)的蛋白在類中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，以及缺血性中風(fēng)與出血性中風(fēng)病人組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而鉛濃度在類中風(fēng)和缺血性中風(fēng)病人中有組間差異。

文獻(xiàn)[15]以質(zhì)譜方法定量測定外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中疊氮基丙氨酸標(biāo)記的新生蛋白質(zhì)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生蛋白和總蛋白組在中風(fēng)組與正常對照組間均存在差異，而PBMC新生蛋白組改變更加明顯，可作為新的中風(fēng)標(biāo)記物篩選來源。此外，腦組織和腦脊液樣本可以直接針對中風(fēng)發(fā)作前后的病灶部位、病程進(jìn)展情況以及特定類別病例進(jìn)行分析，其結(jié)果對于臨床診斷具有更重要的意義。Garcia等[16]采用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在患者中風(fēng)后受損傷部位腦區(qū)組織中鑒定到51個蛋白水平發(fā)生了變化，其中凝溶膠蛋白、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2與胱抑素3種蛋白分子與中風(fēng)后遺情況密切相關(guān)。結(jié)合激光捕獲微解剖技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對指定位點(diǎn)蛋白標(biāo)記物的半定量測定。Lian等[17]發(fā)現(xiàn)在中腦動脈閉塞位點(diǎn)，包括輕肽神經(jīng)絲蛋白(NEFL)、人互聯(lián)蛋白神經(jīng)元中間絲蛋白α(INA)、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、髓磷脂堿性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)和2′,3′-環(huán)核苷酸3′-磷酸二酯酶(CNP)在內(nèi)的6種非可溶蛋白分布較為集中，而神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)、神經(jīng)絲重鏈多肽(NEFH)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、微管相關(guān)蛋白Tau蛋白與Ⅲ型β微管蛋白(TUBB3)在腦組織中則是均勻分布的，此結(jié)果表明非可溶性蛋白可以作為位點(diǎn)相關(guān)性的標(biāo)志物，具有進(jìn)一步臨床研究潛力。同樣地，對腦脊液中蛋白質(zhì)組的分析有助于找到中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的標(biāo)志物，對腦部疾病有很好的診斷意義，因而吸引了不少研究關(guān)注[18-19]。Dayon等[20]采用異構(gòu)體多級質(zhì)譜標(biāo)記(TMT)定量方法對嚴(yán)重腦損傷死亡患者(PM)與臨死前患者(AM)腦脊液樣本中蛋白組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PM組別樣本中鑒定到的78個蛋白含量明顯高于對照組，包括GFAP、S100B蛋白與帕金森氏病蛋白7等之前報道過的蛋白。

1.2 缺血性中風(fēng)病因亞型標(biāo)志物

卵圓孔未閉會導(dǎo)致血栓通過靜脈進(jìn)入動脈循環(huán)，引起中風(fēng)，此類患者往往有較高中風(fēng)風(fēng)險，而血管內(nèi)封閉是常用的治療手段。白蛋白可以作為脂蛋白、小分子和藥物等的載體，具有重要生物活性并受到廣泛研究關(guān)注。為比較一般中風(fēng)與卵圓孔未閉引起的中風(fēng)組間，以及卵圓孔未閉中風(fēng)患者與實(shí)施血管內(nèi)封閉組別的差異，Lopze等[21-22]采用白蛋白免疫富集與高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用的方式，特異性捕獲并定量血漿樣本白蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)白蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)組研究可以成為有力的標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)手段，血管內(nèi)封閉可以對高密度脂蛋白膽固醇及載脂蛋白A1豐度產(chǎn)生影響，對心血管功能提供保護(hù)。Rocchiccioli等[23]發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化有較高的發(fā)病率和死亡率，而頸動脈斑塊破裂導(dǎo)致的急性中風(fēng)約占缺血性中風(fēng)的15%～20%，與組織整體蛋白組相比，斑塊分泌蛋白組學(xué)可以檢測到更有代表性的標(biāo)志物。以非標(biāo)記高分辨質(zhì)譜方法對14個病人頸動脈內(nèi)膜剝離樣本中的分泌蛋白組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血小板反應(yīng)素-1、維生素D結(jié)合蛋白、黏著斑蛋白顯示出異常水平，經(jīng)抗體活性驗(yàn)證，前兩種蛋白在動脈粥樣硬化患者中有著明顯高表達(dá)。MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)是測定物質(zhì)組織分布的強(qiáng)有力手段，對中腦動脈封閉模型小鼠腦組織出現(xiàn)梗塞部位切片與對側(cè)對照部位切片分別進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)13種物質(zhì)含量在梗塞區(qū)域有顯著升高，鑒定結(jié)果表明ATP合成酶5I、細(xì)胞色素C氧化酶亞基VIc和人尿苷酸-胞苷酸激酶3種蛋白表達(dá)有所改變[24]。

2 小分子代謝物標(biāo)志物

代謝產(chǎn)物位于生命活動的下游，能直接地反映組織的生化狀態(tài)。小分子代謝物比蛋白質(zhì)更容易透過血腦屏障，而且與RNA和DNA比較，穩(wěn)定性更好[25]，因此，代謝組學(xué)成為快速和全面分析卒中生物樣本的強(qiáng)有力手段。作為代謝組學(xué)研究常用的技術(shù)平臺，液相質(zhì)譜和氣相質(zhì)譜結(jié)合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度及高分辨率，可用于量化和鑒定復(fù)雜生物醫(yī)學(xué)樣本中低濃度代謝物。因此，利用質(zhì)譜和代謝組學(xué)方法檢測患者代謝水平的差異，進(jìn)而探索IS相關(guān)的生物標(biāo)志物，可指導(dǎo)IS的預(yù)防、診斷和治療過程，并揭示中風(fēng)的生理病理途徑。

2.1 缺血性中風(fēng)標(biāo)志物

Jiang等[26]利用UPLC-TOF MS分析了67名超急性卒中患者和62名健康受試者的血清樣本，發(fā)現(xiàn)卒中患者體內(nèi)半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、氧化性谷胱甘肽、羥基二十碳四烯酸和羥基十八碳二烯酸的濃度升高，而葉酸、四氫葉酸、腺苷、醛固酮、去氧喋呤、蔗糖-6-磷酸和甜菜堿水平顯著性降低，并建立了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型預(yù)測中風(fēng)的可能性。多項(xiàng)代謝組學(xué)研究表明，缺血性卒中患者血液中谷氨酸增加，賴氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和絲氨酸減少[27-30]。Kimberly等[27]通過靶向分析證實(shí)超急性中風(fēng)患者血漿中纈氨酸以及其他支鏈氨基酸(亮氨酸和異亮氨酸)水平降低，且支鏈氨基酸血漿水平降低的幅度與卒中患者的梗死面積和臨床殘疾相關(guān)。另外，一項(xiàng)前瞻性研究表明，基線支鏈氨基酸增加會增加心血管疾病尤其是缺血性卒中的風(fēng)險[31]。為了區(qū)分缺血性和出血性中風(fēng)，Hu等[32]鑒定了缺血性(n=129)和出血性(n=73)中風(fēng)的差異代謝物(如天冬酰胺、瓜氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和纈氨酸)。

有學(xué)者對中國30歲至79歲中風(fēng)患者(1 146例IS患者，1 138例ICH患者)進(jìn)行巢式病例對照研究，探討血漿代謝指標(biāo)與發(fā)生缺血性中風(fēng)和腦出血風(fēng)險之間的關(guān)系，結(jié)果表明膽固醇與IS負(fù)相關(guān)，甘油三酯與IS正相關(guān)，但是與ICH無關(guān)[33]。已有研究采用脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法對脂質(zhì)代謝物與缺血性卒中之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行評估。這些研究結(jié)果表明，脂質(zhì)分子可能在缺血性卒中的病因?qū)W中扮演著雙重角色，即有些脂類增加會導(dǎo)致中風(fēng)風(fēng)險增加，而有些脂類水平提高使中風(fēng)風(fēng)險降低。具體而言，神經(jīng)酰胺、二酰基甘油、二十二碳三烯酸、羥基二十碳四烯酸、羥基十八碳二烯酸、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和三?；视退坪踉黾恿巳毖灾酗L(fēng)的風(fēng)險[26,29,34-35]。在缺血性中風(fēng)患者中，不飽和脂肪酸側(cè)鏈脂質(zhì)、膽固醇、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、游離脂肪酸、葡糖神經(jīng)酰胺、磷脂酰乙醇胺、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇和LPC含量減少[29,35-37]；LPC(16∶0)水平降低或者LPC(20∶4和20∶5)水平提高都會增加罹患缺血性卒中的風(fēng)險[29,35,37]；而血漿LPC(16∶0和20∶4)聯(lián)合其他指標(biāo)(血壓、臨床特征、癥狀持續(xù)時間等)可用于預(yù)測卒中復(fù)發(fā)。代謝組學(xué)也被用于預(yù)測急性缺血性病變的神經(jīng)影像學(xué)特征，共有211種代謝物與缺血性損傷體積相關(guān)，包括LPC(20∶4和22∶6)、次黃嘌呤/蘇氨酸、亮氨酸和其他3種未知化合物[38]。有研究[39]采用非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法來區(qū)分癥狀性和無癥狀的頸動脈粥樣硬化斑塊，結(jié)果顯示磷脂酰膽堿(16∶0/20∶4和16∶0/18∶1)、磷脂酰乙醇胺(18∶1/18∶0)、花生四烯酸和未鑒定的脂質(zhì)代謝物在內(nèi)的許多標(biāo)志物能更好地預(yù)測中風(fēng)風(fēng)險。Mariona等[23]采用LC-MS對131例TIA患者的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示LPC(16∶0)與中風(fēng)復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，而且LPC(20∶4)也可以作為中風(fēng)復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，這組新的標(biāo)志物對中風(fēng)復(fù)發(fā)的預(yù)測能力比傳統(tǒng)的預(yù)測方法更準(zhǔn)確。

2.2 缺血性中風(fēng)病因分型標(biāo)志物

雖然目前的診斷手段可以對大動脈粥樣硬化、小動脈腦卒中和心源性腦栓塞進(jìn)行診斷，仍然有約30%的患者出院時病因未明[40]。尋找IS分型相關(guān)的生物標(biāo)志物，了解未明病因患者的發(fā)病原因，實(shí)施針對性的治療和相應(yīng)的二級預(yù)防措施，可以降低其中風(fēng)復(fù)發(fā)率。在缺血性卒中病因分型標(biāo)志物的檢測研究中，Nelson等[41]使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定了367名急性卒中患者血漿樣本中的144種代謝物，將心源性和非心源性樣本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三羧酸代謝物琥珀酸、α-酮戊二酸和蘋果酸與心源性IS相關(guān)。此外，通過二分法預(yù)測琥珀酸鹽與卒中復(fù)發(fā)有關(guān)。Nielsen等[42]在小鼠永久性局灶性腦缺血2 h、24 h、5 d、7 d和20 d后，對小鼠腦切片進(jìn)行質(zhì)譜成像以了解腦部炎癥發(fā)生過程中特征化合物的時空變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙單酰甘油磷酸酯BMP(22∶6/22∶6)和N-?；?磷脂酰乙醇胺可分別作為吞噬巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和死亡神經(jīng)元的潛在生物標(biāo)志物。許多其他化合物被發(fā)現(xiàn)與缺血性中風(fēng)亞型息息相關(guān)，比如二十二碳六烯酸(DHA)、15-脫氧-△12，14-前列腺素J2(15-d-PGJ2)、神經(jīng)酰胺和氧化型磷脂與低風(fēng)險動脈粥樣硬化中風(fēng)有關(guān)，二十二碳五烯酸(DPA)可以降低心源性IS的風(fēng)險[43-44]，同型半胱氨酸等與腔隙性中風(fēng)相關(guān)[45-48],但對于IS病因亞型標(biāo)志物的研究仍然很有限。

3 總結(jié)與展望

基于質(zhì)譜的各種方法已被應(yīng)用于尋找缺血性中風(fēng)標(biāo)志物，并已發(fā)現(xiàn)了一些蛋白質(zhì)和小分子標(biāo)志物，主要有S100B、GFAP、UCH-L1、NSE、氨基酸、脂質(zhì)[25,49-50]。這些標(biāo)志物表達(dá)變化有可能可以用于診斷中風(fēng)以及缺血性中風(fēng)病因分型，但在樣本收集、研究結(jié)果一致性方面尚需更多驗(yàn)證，而且在臨床應(yīng)用方面需要作進(jìn)一步探究。此外，亦有研究指出單一標(biāo)志物因其特異性和靈敏度的不足，在實(shí)際臨床應(yīng)用方面仍有局限性，而以一組標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)志在臨床上會更有效[51]，組學(xué)研究亦需要有更統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)志物篩選以及統(tǒng)計(jì)分析方法。在樣本類型方面，有研究表明[52]外泌體是疾病階段特異性信息的重要來源，而且可以透過血腦屏障，是中風(fēng)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的有利樣本來源。另外，隨著質(zhì)譜新技術(shù)的發(fā)展，直接分析質(zhì)譜技術(shù)，如實(shí)時直接分析(Directanalysis in real time,DART)和解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization,DESI)技術(shù)[53-54]，可以快速分析樣本，在提高分析靈敏度和準(zhǔn)確率的同時，縮短中風(fēng)診斷時間，因此開發(fā)基于直接質(zhì)譜的診斷方法顯得尤為重要。