光質(zhì)對(duì)紅茶萎凋葉蛋白酶和淀粉酶活性及相關(guān)成分的影響

羅紅玉，王 奕，楊 娟，袁林穎，翟秀明，唐 敏，王 杰，黃尚俊，鐘應(yīng)富*

(1. 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，重慶 永川 402160；2. 重慶市茶葉工程技術(shù)研究中心，重慶 永川 402160；3. 國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系重慶綜合試驗(yàn)站，重慶 永川 402160)

【研究意義】萎凋是紅茶加工的第一道也是最關(guān)鍵的工序，即是將采回的茶鮮葉進(jìn)行薄攤，讓其散失一部分水分的工藝處理過程[1]，同時(shí)也是茶鮮葉采后自然衰老的過程。在萎凋過程中，伴隨著系列生理化學(xué)變化。萎凋葉品質(zhì)的好壞直接決定了紅茶品質(zhì)的優(yōu)劣?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，光質(zhì)萎凋可促進(jìn)氨基酸總量的增加、減少總糖含量[2-3]，顯著提升茶葉香氣、鮮爽度及綜合感官品質(zhì)[4]。一直以來，普遍認(rèn)為茶鮮葉在萎凋過程中游離氨基酸和可溶性糖含量的上升來源于蛋白質(zhì)、淀粉的水解[5-7]。研究者在白茶萎凋過程中，發(fā)現(xiàn)大部分參與氨基酸和蛋白質(zhì)合成的蛋白發(fā)生顯著下調(diào)，而大部分參與蛋白質(zhì)水解的蛋白發(fā)生顯著上調(diào)，表明蛋白質(zhì)水解是游離氨基酸含量升高的主要原因[8]。目前，茶葉中蛋白、蛋白酶及淀粉、淀粉酶的研究只見少量報(bào)道，研究表明人工光照萎凋可提前使萎凋葉中的蛋白酶活性達(dá)高峰，且高于室內(nèi)自然萎凋[9]，曬青和做青利于蛋白酶、淀粉酶的活化，做青可降低淀粉含量，利于氨基酸、可溶性蛋白及可溶性糖的積累[10-11]。在茶葉中，蛋白質(zhì)含量豐富，約占干重的20 %～30 %，主要包括谷蛋白(82.05 %)、醇溶蛋白(13.61 %)、白蛋白(3.47 %)和球蛋白(0.87 %)，其中只有1 %～2 %能溶于水，絕大部分不能溶于水而殘留在茶渣中[1, 12]。本項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)采用透射電鏡觀察了紅茶萎凋過程中葉片的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鮮葉中的大粒淀粉變成了小粒淀粉甚至消失[13]，還發(fā)現(xiàn)，黃光萎凋可提高萎凋葉中氨基酸、可溶性糖含量，藍(lán)光萎凋可降低萎凋葉中茶多酚含量，兩種光質(zhì)能顯著提高紅茶感官品質(zhì)，所制紅茶外形烏黑較潤、較緊細(xì)直，湯色紅、明亮，甜香顯，滋味醇厚，葉底紅亮[14]。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)萎凋過程中，不同光質(zhì)如何通過影響萎凋葉蛋白酶和淀粉酶的活性，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、淀粉、氨基酸、可溶性糖含量仍然未知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】實(shí)驗(yàn)以室內(nèi)自然萎凋?yàn)閷?duì)照，通過研究黃光、藍(lán)光萎凋過程中蛋白酶、淀粉酶及相關(guān)成分的變化規(guī)律，并探討其相關(guān)性，以期為紅茶設(shè)施萎凋中光質(zhì)的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試原料為2017年9月采摘的福鼎大白(Camelliasinensiscv. ‘Fuding-dabaicha’)一芽二葉鮮葉，采自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所實(shí)驗(yàn)茶園 (北緯29°75′，東經(jīng)105°71′，海拔440 m)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

光質(zhì)萎凋槽：本實(shí)驗(yàn)室自制；6CR-40揉捻機(jī)：四川省名山縣山峰茶機(jī)廠；6CH-54茶葉烘焙箱：福建安溪興民茶葉機(jī)械廠；HB43-S水分測定儀：梅特勒-托利多國際股份有限公司；TU 1901紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理

在28 ℃條件下，采用2種不同的LED光源(黃光585 nm、藍(lán)光460 nm，光強(qiáng)均為1500 lx)進(jìn)行萎凋，對(duì)照為室內(nèi)自然萎凋，萎凋時(shí)間20 h，萎凋結(jié)束時(shí)黃光組、藍(lán)光組、對(duì)照組萎凋葉含水量分別為59.5 %、56.3 %、59.8 %。被照射葉量3.5 kg，攤?cè)~厚度3～5 cm。

萎凋過程中，各萎凋組每4 h取樣10 g測定水分，重復(fù)3次；同時(shí)取30 g樣置于液氮速凍后保存于-20 ℃，再選擇芽下第2葉用于測定蛋白酶及淀粉酶活性，以及總蛋白和淀粉含量；另取150 g萎凋葉先蒸汽殺青2 min后再80 ℃烘至足干，用于測定萎凋葉游離氨基酸及可溶性糖含量。

1.4 檢測方法

酸性蛋白酶(Acid protease，ACP)、淀粉酶(Amylsse)活性，蛋白質(zhì)及淀粉含量均采用試劑盒測定，購置于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；游離氨基酸測定采用GB/T 8314-2013；可溶性糖測定采用硫酸-蒽酮比色法[15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理繪圖、SPASS 17.0進(jìn)行方差分析。測定結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，處理間平均值差異顯著性用最小顯著差異法(LSD)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)萎凋葉蛋白酶及淀粉酶的活性變化

萎凋過程中，各萎凋組的蛋白酶活性均呈升-降-升趨勢(圖1)。0～4 h為迅速升高階段，萎凋至4 h，黃光組蛋白酶活性達(dá)最高，為1050.21 nmol·min-1·g-1，比茶鮮葉升高了7.4倍，與萎凋結(jié)束時(shí)相當(dāng)，顯著高于其余萎凋時(shí)段和萎凋組(P<0.5)，其次為對(duì)照組，而藍(lán)光組升高不顯著(P>0.05)；4～12 h為降低階段，萎凋至8 h，黃光組、對(duì)照組迅速降低，藍(lán)光組略有降低，萎凋至12 h，黃光組、對(duì)照組持續(xù)降低，蛋白酶活性與茶鮮葉無顯著差異，藍(lán)光組略有升高，此時(shí)，各萎凋組蛋白酶活性之間無顯著差異；12～20 h為再次升高階段，黃光組、對(duì)照組幾乎呈線性升高，藍(lán)光組在16 h處略有降低，隨后顯著升高，萎凋結(jié)束時(shí)，各組間無顯著差異，其中黃光組最高，為505.75 nmol·min-1·g-1。

圖1 不同光質(zhì)萎凋過程中萎凋葉蛋白酶活性的變化Fig.1 The change of protease activity in tea leaves during different light withering

萎凋過程中，各萎凋組的總淀粉酶、β-淀粉酶活性變化總體呈升-降-升趨勢(圖2～3)。0～4 h為酶活性迅速升高階段，萎凋第4小時(shí)處，對(duì)照組的2種酶活性最高，分別為101.00、84.61 mg·min-1·g-1，比茶鮮葉升高了2.1、3.9倍，顯著高于其余萎凋時(shí)段和萎凋組，其次為黃光組，2種酶活性較高，分別升高了1.6、3.1倍，而藍(lán)光組較低，分別升高了1.1、2.0倍，后兩組的總淀粉酶活性無顯著差異；在4～16 h過程中，2種酶活性有升有降，對(duì)照組在第16 h處最低，分別為47.23、40.82 mg·min-1·g-1，黃光組在第16 h處最低，分別為40.41、32.16 mg·min-1·g-1，藍(lán)光組在第12 h處最低，分別為46.51、34.51 mg·min-1·g-1；萎凋結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的總淀粉酶活性顯著升高，藍(lán)光組顯著降低，而黃光組升高不顯著，其酶活性最低，三者間差異顯著，各萎凋組的β-淀粉酶活性升高不顯著，藍(lán)光組最高、黃光組最低，處理間差異顯著。

圖2 不同光質(zhì)萎凋過程中萎凋葉總淀粉酶活性的變化Fig.2 The change of total amylase activity in tea leaves during different light withering

圖3 不同光質(zhì)萎凋過程中萎凋葉β-淀粉酶活性的變化Fig.3 The change of β-amylase activity in tea leaves during different light withering

萎凋過程中，各萎凋組的α-淀粉酶活性變化趨勢不盡一致(圖4)。對(duì)照組在0～8 h期間均無顯著變化，8～16 h期間迅速下降，16 h處最低，為6.41 mg·min-1·g-1，顯著低于其余萎凋時(shí)段和萎凋組，萎凋結(jié)束時(shí)又顯著升高至13.76 mg·min-1·g-1；黃光組在0～8 h期間無顯著變化，隨后持續(xù)降低，萎凋結(jié)束時(shí)最低，為7.43 mg·min-1·g-1，顯著低于0～8 h；藍(lán)光組在0～4 h期間迅速升高，4 h處最高，為17.53 mg·min-1·g-1，升高了11.5 %，隨后逐漸降低，萎凋結(jié)束時(shí)低至10.06 mg·min-1·g-1。

圖4 不同光質(zhì)萎凋過程中萎凋葉α-淀粉酶活性的變化Fig.4 The change of α-amylase activity in tea leaves during different light withering

2.2 不同光質(zhì)萎凋葉蛋白酶、淀粉酶相關(guān)成分的變化

從表1可知，隨萎凋進(jìn)程，黃光組蛋白質(zhì)含量先降后升，藍(lán)光組呈降-升-降趨勢，對(duì)照組呈緩慢降低趨勢；各組萎凋葉的游離氨基酸含量均呈升-降-升趨勢。

表1 不同光質(zhì)萎凋過程中萎凋葉氨基酸及蛋白質(zhì)含量的變化

就蛋白質(zhì)含量而言，0～4 h為迅速降低階段。第4小時(shí)處，降幅由大到小為黃光>藍(lán)光>對(duì)照，降幅分別為53.7 %、47.5 %、15.9 %，各萎凋組間差異顯著。4～16 h為黃光組持續(xù)降低階段，萎凋第12、16小時(shí)處，顯著低于其余時(shí)段，分別降低了63.9 %、63.7 %；萎凋結(jié)束時(shí)迅速升高，并與茶鮮葉相當(dāng)。4～8 h為藍(lán)光組持續(xù)降低階段，第8小時(shí)處最低，降低了48.5 %；12 h處有較大幅度提升，隨后緩慢降低。4～20 h對(duì)照組呈緩慢降低趨勢，萎凋結(jié)束時(shí)最低，降低了22.4 %。

就游離氨基酸含量而言，0～4 h為迅速升高階段。第4小時(shí)處，升高幅度由大到小為藍(lán)光>對(duì)照>黃光，分別升高了42.0 %、38.1 %、27.6 %，前兩者均升至最高，三者間無顯著差異。4～12 h為黃光組持續(xù)升高階段，12 h處最高，升高了53.3 %，顯著高于其余萎凋組，16 h處降低，萎凋結(jié)束時(shí)升高33.7 %，顯著高于其余萎凋組。4～12 h為藍(lán)光組持續(xù)降低階段，12 h處顯著降低，與茶鮮葉相當(dāng)，16 h處升高，萎凋結(jié)束時(shí)無顯著變化。對(duì)照組在4～8 h期間維持較高水平，但與后續(xù)萎凋時(shí)段無顯著差異。

從表2可知，各萎凋組總淀粉含量變化趨勢存在差異，黃光組呈升-降-升趨勢，藍(lán)光組逐漸降低，對(duì)照組先降后升；對(duì)照組可溶性糖含量呈升-降-升趨勢，黃光組和藍(lán)光組呈先升后降趨勢。

表2 不同光質(zhì)萎凋過程中可溶性糖及總淀粉含量的變化

就總淀粉含量而言，黃光組在第4小時(shí)顯著升高，顯著高于其余萎凋時(shí)段和萎凋組，升高了8.3 %，在8～16 h過程中快速降低，顯著低于其余萎凋時(shí)段，萎凋結(jié)束時(shí)，顯著升高。藍(lán)光組在萎凋結(jié)束時(shí)降至最低，降幅26.0 %。對(duì)照組在第12小時(shí)處降至最低，顯著低于其余萎凋時(shí)段，降幅29.6 %，16～20 h又升高。

就可溶性糖含量而言，黃光組在第4小時(shí)達(dá)最高，為6.14 %，但與茶鮮葉無顯著差異，8～16 h顯著降低。藍(lán)光組、對(duì)照組在第12、8小時(shí)處達(dá)最高，分別升高了15.7 %、12.6 %，顯著高于茶鮮葉。萎凋結(jié)束時(shí)，藍(lán)光組、對(duì)照組與鮮葉無顯著差異，而黃光組則較鮮葉減少了11.7 %。

2.3 蛋白酶、淀粉酶活性及成分間的相關(guān)性

上述實(shí)驗(yàn)表明，黃光萎凋能在4 h內(nèi)快速提高蛋白酶活性，并在隨后的萎凋進(jìn)程中，保持較高水平，能快速降低蛋白質(zhì)含量，持續(xù)提高游離氨基酸含量，還可延緩總淀粉酶、β-淀粉酶活性的降低，迅速提升總淀粉含量。為進(jìn)一步揭示黃光萎凋?qū)ο嚓P(guān)物質(zhì)的影響規(guī)律，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了黃光萎凋過程中，蛋白酶、淀粉酶活性及成分間的相關(guān)性。從表3可知，蛋白酶活性與蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與游離氨基酸含量呈正相關(guān)，但未達(dá)顯著水平；蛋白質(zhì)含量與游離氨基酸含量呈較大負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.586，說明蛋白質(zhì)的減少對(duì)游離氨基酸的積累有較大貢獻(xiàn)?？偟矸勖浮ⅵ?淀粉酶、β-淀粉酶活性均與總淀粉、可溶性糖含量呈正相關(guān)，其中，α-淀粉酶活性與可溶性糖含量存在極顯著正相關(guān)，系數(shù)為0.932；3種淀粉酶活性之間存在正相關(guān)，其中，總淀粉酶活性與β-淀粉酶活性存在極顯著正相關(guān)，系數(shù)為0.989；總淀粉含量與可溶性糖含量存在較大正相關(guān)。蛋白酶活性與淀粉酶活性、淀粉、可溶性糖含量間均存在一定正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量與淀粉酶活性存在負(fù)相關(guān)，尤其與總淀粉酶和β-淀粉酶活性存在較大負(fù)相關(guān)，而與總淀粉以及可溶性糖含量存在正相關(guān)，游離氨基酸含量與總淀粉酶和β-淀粉酶活性存在較大正相關(guān)，與α-淀粉酶活性、總淀粉和可溶性糖含量存在一定負(fù)相關(guān)。

表3 萎凋葉蛋白酶、淀粉酶活性與成分間的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

蛋白酶可將茶葉中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸，不僅能改善茶葉的香氣和鮮爽度，而且可減少不溶性復(fù)合物產(chǎn)生，提高茶湯質(zhì)量[16]。淀粉酶是一種重要的水解酶，是水解淀粉和糖原的一類酶的總稱，淀粉酶作用于α-1,4-糖苷鍵，使淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖、極限糊精等[17-18]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在萎凋過程中，各萎凋組的蛋白酶、總淀粉酶和β-淀粉酶活性，以及游離氨基酸含量均呈升-降-升趨勢，黃光組蛋白酶活性高于藍(lán)光組與對(duì)照組，可溶性糖含量變化規(guī)律存在差異；萎凋至4 h，黃光組的蛋白酶活性、對(duì)照組的總淀粉酶活性和β-淀粉酶活性、藍(lán)光組的α-淀粉酶活性均最高，分別比茶鮮葉升高7.4倍、2.1倍、3.9倍、11.5 %；萎凋至12 h，黃光組的蛋白質(zhì)含量最低，降低63.9 %，游離氨基酸含量最高，升高53.3 %，對(duì)照組總淀粉含量最低，降幅29.6 %，藍(lán)光組的可溶性糖含量最高，升高15.7 %。相關(guān)性分析表明，黃光組的蛋白酶活性與蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與游離氨基酸呈正相關(guān)，但未達(dá)顯著水平，而蛋白質(zhì)含量與游離氨基酸含量呈較大負(fù)相關(guān)，系數(shù)為-0.586；α-淀粉酶活性與可溶性糖含量、總淀粉酶活性與β-淀粉酶活性均存極顯著正相關(guān)，系數(shù)分別為0.932、0.989。結(jié)果表明，在所選的光質(zhì)萎凋條件下，黃光萎凋能顯著提高萎凋葉蛋白酶活性和游離氨基酸含量，降低蛋白質(zhì)含量；藍(lán)光萎凋和室內(nèi)自然萎凋則可提高萎凋葉淀粉酶活性和可溶性糖含量，降低總淀粉含量。

實(shí)驗(yàn)僅僅檢測了蛋白酶促水解過程中酸性蛋白酶的活性及游離氨基酸含量，而蛋白質(zhì)除了參與酶促水解外，還存在其他降解途徑，比如胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解[17]，其他蛋白水解酶如肽鏈內(nèi)切酶、外切酶等與蛋白質(zhì)的關(guān)系可能更加密切，同時(shí)，蛋白質(zhì)在水解過程中，會(huì)產(chǎn)生多肽，最后再生成游離氨基酸。另外，植物葉片中淀粉的水解途徑涉及葡聚糖-水雙激酶、異淀粉酶、磷酸葡聚糖磷酸酶、淀粉酶等多種酶類[19-20]，而本實(shí)驗(yàn)僅僅檢測了淀粉酶類。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出蛋白酶活性與蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量之間，總淀粉酶與淀粉、可溶性糖之間均無顯著相關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將深入分析萎凋葉中蛋白和淀粉水解的酶類、活性及其在水解過程中的貢獻(xiàn)程度，以明確關(guān)鍵的蛋白水解酶和淀粉水解酶，為茶葉萎凋工藝的改善提供更為確切的理論依據(jù)。