荷葉堿的分離純化與HPLC檢測

李 楊，吳 嬌，朱釗銘，劉 驍，石玉生，李春斌

(1.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605;2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541199)

荷葉即睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的葉，其主要組成部分有葉片、葉柄和荷蒂(即葉片與葉柄相接的部分)。蓮屬植物雖然種類少但分布極其廣泛，除青海、西藏等西北地區(qū)以外，全國各地均有分布，并主要集中在長江、黃河和珠江三大流域，其中以浙江、江蘇、湖南、湖北等地為主。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，荷葉性平、味苦，歸脾、肝、胃經(jīng)，具有清熱解暑，涼血止血，生發(fā)清陽的功效[1]。《本草綱目》上有明確記載“荷葉服之，令人瘦劣，單服可消陽氣浮腫之氣”、“生發(fā)元?dú)?，禪助脾胃，澀精濁，散淤血，消腫痛，發(fā)痘瘡”。在2002年初監(jiān)發(fā)的中華人民共和國衛(wèi)生部的衛(wèi)法〔2002〕51號文件中，荷葉被列入“既是食品又是藥品”的名單之中[2]。

荷葉堿(Nuciferine)是一種阿樸啡類生物堿，是荷葉生物堿中主要成分之一，在國際上規(guī)定 80%以上的純度的荷葉堿即為高純度荷葉堿，目前國內(nèi)的荷葉堿制備水平較低，主要依賴國外進(jìn)口高純度荷葉堿[3]。高純度荷葉堿晶體為白色，純度越高顏色越接近白色，荷葉堿可溶于酸水，甲醇等有機(jī)溶劑，不溶于堿水，分子式 C19H21NO2，分子量 295.376[4]，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 荷葉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

荷葉生物堿大部分呈弱堿性，在水中的溶解性較差，一般以游離態(tài)的形式存在，但能很好地溶解于氯仿、乙醚、乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。由于生物堿在偏酸性條件下能生成可溶性鹽，因此能溶于偏酸性的水溶液。在此前提下，荷葉中生物堿類物質(zhì)的提取一般采用有機(jī)溶劑法，為了提高得率，一般輔助以超臨界萃取、超聲波萃取、微波萃取等方式。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

實(shí)驗(yàn)原材料荷葉購于鳳城市仁和中藥飲片有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)過程中所用試劑均購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：UV2450型紫外可見光譜儀(日本島津)；IRPrestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)；LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 方 法

1.2.1 荷葉總生物堿的提取

根據(jù)生物堿適用酸提堿沉的原理，本實(shí)驗(yàn)中荷葉堿的提取采用了在50%乙醇提取溶液中加入稀鹽酸調(diào)pH的方法[5]，用TLC法檢測結(jié)果。

用電子天平準(zhǔn)確稱取20.0 g荷葉粉末，倒入兩口圓底燒瓶中。用膠頭滴管向50%乙醇溶液中緩慢滴加0.2%HCl溶液，調(diào)至pH=2.0，量取200 mL溶液倒入荷葉粉末中，60 ℃水浴回流提取2 h[6]。提取完成后，提取液過濾，保存過濾后的提取液，殘?jiān)凑丈鲜霾襟E再次提取，收集合并提取液。提取液減壓濃縮后得總生物堿浸膏[7]，稱量得到的黑色浸膏為1.45 g，浸膏得率為7.25%。

以三氯甲烷：無水乙醇=10∶1為展開劑，以荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品作為對照進(jìn)行TLC檢測并記錄。

1.2.2 荷葉堿的陽離子交換樹脂純化

據(jù)文獻(xiàn)報道[8]，用離子交換樹脂進(jìn)行柱色譜分離荷葉堿效果較好，本實(shí)驗(yàn)先用強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂進(jìn)行荷葉堿分離的實(shí)驗(yàn)。

總生物堿浸膏用pH=2.0的50%乙醇溶液溶解，洗脫液為氨水：無水乙醇：去離子水=3∶40∶57。樣品以5 ml·min-1的流速動態(tài)上樣，用錐形瓶采集下方漏出液。上樣完成后，用上述配制的洗脫液以5 ml·min-1的流速洗脫。待洗脫液有氨水味道時開始收集洗脫液，而且對洗脫液進(jìn)行TLC檢測。收集含有荷葉堿的洗脫液，以荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品為對照，進(jìn)行紫外光譜檢測。洗脫液經(jīng)減壓濃縮后得荷葉堿粗品，因荷葉堿粗品中還含有無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，需對粗品進(jìn)行萃取，萃取溶劑為石油醚。用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行萃取[9]，萃取時間為30 min，溫度60 ℃，同樣條件萃取兩次，收集萃取液。

1.2.3 荷葉堿的大孔吸附樹脂純化

將荷葉總生物堿浸膏采用HPD-100大孔樹脂進(jìn)行柱色譜分離[10]，用50%～70%的乙醇溶液梯度洗脫。收集各梯度洗脫液并進(jìn)行TLC檢測，至洗脫液中加碘化鉍鉀無桔紅色沉淀，減壓濃縮成浸膏，得到純化后的總生物堿。

1.2.4 荷葉堿的硅膠柱層析純化

多次試驗(yàn)證明用樹脂進(jìn)行柱色譜分離并不能使荷葉堿單獨(dú)分離出來，但是能得到初步純化的總生物堿。因此在用樹脂純化獲得總生物堿的基礎(chǔ)上，對荷葉總生物堿進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱色譜的分離。

通過TLC法確定流動相及其比例為，二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。稱取硅膠(100-200目)330 g，置于大燒杯中，用適量流動相浸泡，并用玻璃棒攪拌至無氣泡，將硅膠倒入層析柱中，使硅膠床面平滑，流動相沖洗硅膠至干凈[7]。將樣品上樣，加流動相進(jìn)行洗脫，流速為3 ml·min-1。根據(jù)薄層板情況更換流動相比例，至洗脫液加入碘化鉍鉀無桔紅色沉淀生成。

1.2.5 紫外吸收光譜的檢測

準(zhǔn)確稱量荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定量的乙醇溶液中，以乙醇為空白對照，在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見分光光度的掃描，將提取的樣品的紫外掃描圖譜與荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜進(jìn)行比較與分析。

1.2.6 紅外吸收光譜的檢測

取KBr粉末200～250 mg在瑪瑙研缽中充分研磨，將研磨好的物料置于壓片模具中鋪勻，合上模具置壓片機(jī)上加壓至80 MPa，壓片3 min左，取少量配置好的0.1 mg·mL-1的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液均勻滴加在溴化鉀片上，將樣品架置于光譜儀中檢測。荷葉堿提取物的檢測方法同上，將提取的荷葉堿與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖進(jìn)行對比與分析。

1.2.7 高效液相色譜的檢測

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別精密稱取荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品和自制樣品粉末2.50 mg，置25 mL容量瓶中，用乙腈(色譜純)溶解并定容至刻度，其它幾種低濃度的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋制得。

(2)液相色譜條件。用于檢測樣品的色譜柱為OP C18-101002546柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相A：0.1%三氟乙酸溶液，B：乙腈[8]。梯度洗脫條件為：0～15 min B(20%～40%)，15～20 min B(40%～60% )，20～25 min B(60%～100%)。檢測波長：270 nm，進(jìn)樣量：20 μL，流速：0.8 ml·min-1。

(3)檢測樣品溶液的準(zhǔn)備。將定容后的荷葉堿樣品在1 000 r·min-1，10 min條件下離心，取離心后上清液用2 mL的無菌注射器經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取過膜后的濾液作為液相檢測溶液。

(4)流動相的準(zhǔn)備。將三氟乙酸(色譜純)按0.1%的比例加入到經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過膜后的超純水中，乙腈和0.1%三氟乙酸溶液使用前需超聲30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉堿提取結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)提取的總生物堿經(jīng)TLC檢測有與荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同的點(diǎn)，均為0.6，證明用酸調(diào)節(jié)溶液的pH值有利于荷葉堿的提取。

2.2 不同純化方法對荷葉堿分離純化效果的影響

采用陽離子交換樹脂、大孔吸附樹脂以及硅膠柱層析法分別對荷葉堿進(jìn)行純化，經(jīng)TLC檢測后可知,雖然3中方法對荷葉堿都有一定的分離純化作用，但對比之下硅膠柱層折法分離純化效果最佳。

2.3 紫外吸收光譜的檢測圖譜與分析

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的紫外吸收圖譜如圖2-3。

根據(jù)圖2荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收圖譜可以看出，荷葉堿在270 nm處的吸光度值最大，而提取的樣品經(jīng)過紫外全波長掃描可以確定在270 nm處也有吸收，且峰型較為相似，由此可說明提取液中含有純度較高的荷葉堿。

圖2 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品紫外譜圖

圖3 荷葉堿樣品紫外譜圖

由圖2荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收圖譜可以看出，荷葉堿在270 nm處的吸光度值最大，而提取的樣品經(jīng)過紫外全波長掃描可以確定在270 nm處也有吸收，且峰型較為相似，由此可初步證明提取液中可能含有純度較高的荷葉堿。

2.4 紅外吸收光譜的檢測圖譜與分析

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的紅外吸收光譜圖如圖4-5。

圖4 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品紅外譜圖(KBr壓片)

圖5 荷葉堿樣品紅外譜圖(KBr壓片)

而由圖4和圖5的紅外譜圖可知，實(shí)驗(yàn)所得荷葉堿樣品與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖的特征峰基本相符，主要特征峰的位置及峰型變化不大。

2.5 高效液相色譜的檢測結(jié)果與分析

經(jīng)多次檢測確定荷葉堿在270 nm處有最大吸收峰，因此HPLC分析所選用的波長為270 nm，HPLC分析結(jié)果如圖6-8。

圖6 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品液相譜圖

圖7 荷葉粗提液液相譜圖

圖8 荷葉堿樣品液相譜圖

如圖6荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測譜圖所示，荷葉堿的保留時間為14.646 min。如圖8所示的荷葉堿樣品的HPLC檢測譜圖，荷葉堿的保留時間為14.736 min，與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。從高效液相色譜圖可以看出，本實(shí)驗(yàn)購買的標(biāo)準(zhǔn)品含有一定量的雜質(zhì)，也反應(yīng)出純化荷葉堿是個世界難題。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品也需要在另外的公司重新購買，以便于實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行。

2.6 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程

本實(shí)驗(yàn)共配制了0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1以及0.10 mg·mL-1五個濃度，制作線性回歸方程以液相譜圖峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，以荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)(X)，結(jié)果見表1和圖9，得線性回歸方程y = 40 979x+6.993 9，R2=0.996 1 。由標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0.02～0.10 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

表1 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積 /mAU

圖9 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

荷葉堿樣品的HPLC數(shù)據(jù)如下：

保留時間為14.736 min，峰面積為2 514.962 2，代入線性回歸方程可得自制荷葉堿樣品含量為0.061 2 mg·mL-1。

(1)

(2)

3 結(jié) 論

以荷葉為原料，研究了提取方法、提取溶劑的種類、濃度、pH、提取溫度等對荷葉堿提取率的影響。用在冷凝回流前加入稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0的方法對荷葉堿進(jìn)行提取，采用強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂對荷葉堿進(jìn)行了初步分離純化，樹脂洗脫液為3%氨水、40%無水乙醇和57%的水，洗脫速度為5 ml·min-1，然后采用硅膠柱層析的方法對荷葉堿再次進(jìn)行分離純化，所用硅膠為100-200目，流動相為二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。并用TLC法、紫外光譜法、紅外光譜法以及高效液相色譜法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，pH為2.0的50%乙醇水浴回流法適于荷葉堿的提取，陽離子交換樹脂和硅膠柱層析組合技術(shù)可分離純化得到純度為94.15%的荷葉堿，得率3.196%。