脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的制備、改性與應(yīng)用前景

蘇東 ，冷凱良，劉小芳，張俊杰

1. 江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院（連云港 222000）；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（青島 266071）

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（ADM）是指不同來源的皮膚經(jīng)脫細(xì)胞工藝處理，將皮膚組織中抗原性較強(qiáng)的組分，包括表皮、皮膚附屬器（毛囊、皮脂腺、汗腺）、真皮內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等去除后，所剩余的免疫原性相對(duì)較弱的細(xì)胞外基質(zhì)及真皮層的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。目前市場上常見的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)一般來源于豬、牛、羊和馬，它們的制作工藝和臨床應(yīng)用已趨于完善[2-3]。然而，由于近年來牛海綿狀腦?。˙SE）和高致病性禽流感（HPAI）等人畜共患病頻發(fā)，以及宗教信仰等因素，導(dǎo)致豬、牛等哺乳動(dòng)物的脫細(xì)胞基質(zhì)材料頗受爭議。而魚皮可以較好地規(guī)避宗教壁壘，且具有膠原蛋白含量高、抗原性低、生物安全性高和產(chǎn)量豐富等優(yōu)勢[4]。

1 魚皮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

1.1 魚皮的組成

魚皮一般是由魚鱗、表皮、真皮及皮下組織構(gòu)成，可分為鱗面層、表皮層、真皮層和皮下組織層。表皮層中富含表皮細(xì)胞，可以分泌角質(zhì)，真皮層主要由膠原纖維、糖胺聚糖、彈性纖維等組成，還有一些色素細(xì)胞、血管和脂肪組織等[5-6]。而哺乳動(dòng)物的皮膚，如?；蜇i皮，一般是由表皮層、真皮層和皮下組織層組成；表皮層中富含角化細(xì)胞、基底細(xì)胞和色素細(xì)胞等；真皮層又分為乳頭層和網(wǎng)織層，主要由膠原纖維和彈性纖維組成，包括血管、淋巴管、毛囊、皮脂腺等[7]。

1.2 魚皮中的膠原蛋白

脫細(xì)胞基質(zhì)材料的主要成分是膠原蛋白，魚皮的蛋白質(zhì)含量比魚體的其他部位高，其膠原蛋白含量最高可占其蛋白質(zhì)總量的80%以上[8]。Takeshi等[9]研究表明：鱸魚（Lateolabrax japonicus）皮、骨和鰭中的膠原含量分別為51.4%，40.7%和41.6%（干基）。而常見的哺乳動(dòng)物皮膚，如豬皮中的蛋白質(zhì)含量約為33%，膠原蛋白占總蛋白的比率為87.8%左右[10]。豬皮和魚皮中的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，具有由三條α-肽鏈以右手螺旋形式纏繞成的草繩狀三股螺旋結(jié)構(gòu)。在顯微鏡下觀察，膠原由直徑2～15 μm的膠原纖維組成，多數(shù)成束狀結(jié)構(gòu)，膠原束相互交織成網(wǎng)狀[11]，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的進(jìn)入和生長。

1.3 魚皮中的脂肪酸

魚皮中含有豐富的不飽和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能有效抑制炎癥發(fā)生，減少機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)[12]，Sigurjonsson[13]在制作脫細(xì)胞魚皮過程中，去除了魚鱗和表皮脂肪，保留了真皮層中的脂肪。體外試驗(yàn)表明，脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)表現(xiàn)出良好的生物相容性。而哺乳動(dòng)物的油脂主要為飽和脂肪酸，并無抗菌、抗炎等生物學(xué)功能，一般在脫細(xì)胞前處理過程中將其去除。Baldursson等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在全層皮膚損傷臨床應(yīng)用中，脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)較豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)的愈合速度快，生物相容性好，這可能與魚皮中的不飽和脂肪酸有關(guān)。

2 魚皮的脫細(xì)胞方法

國內(nèi)外對(duì)于脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的制備方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)轸~皮特殊的物理性質(zhì)（如變性溫度低[14]、網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)復(fù)雜[15]等）導(dǎo)致常規(guī)的哺乳動(dòng)物皮膚脫細(xì)胞方法并不完全適用。Sigurjonsson[13]報(bào)道一種用于創(chuàng)傷修復(fù)的脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的制備方法。先去除魚皮表面的鱗片和表皮脂肪，用PBS浸泡以穩(wěn)定魚皮內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理去除細(xì)胞、Tris-HCl和0.05 μg/L胰蛋白酶裂解精氨酸和賴氨酸C端的多肽鍵（無脯氨酸連接）[16]，最后將所得的脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)經(jīng)預(yù)凍液處理后冷凍干燥，再經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌[17]。操作過程中全程控制溫度為4 ℃，魚皮經(jīng)過提前凍融（-70 ℃），更利于脫細(xì)胞處理。制得的脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)較好地保留了膠原纖維三維支架結(jié)構(gòu)。

國內(nèi)學(xué)者王園園等[18]以沙鰻（Astroconger myriaster）魚皮為原材料，去除內(nèi)側(cè)筋膜、脂肪和多余魚肉，用生理鹽水和超純水反復(fù)沖洗后抗壞血酸處理1 h，利用甲酸使基質(zhì)溶脹并去除表皮層，用NaCl浸泡去溶脹，-80 ℃反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解。之后用脫氧膽酸鈉、SDS和0.2 μg/L胰蛋白酶溶液進(jìn)一步脫細(xì)胞，最后用生理鹽水洗滌干凈后凍干成型，60Coγ射線輻照滅菌。制得的脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)機(jī)械性能較好，較好地脫除了細(xì)胞，材料幾乎全為膠原纖維，無PAS陽性物質(zhì)。同時(shí)其DNA含量明顯低于天然魚皮和市售口腔修復(fù)膜，在動(dòng)物試驗(yàn)中無致敏反應(yīng)。

2種制備方法均是利用SDS和胰蛋白酶溶液進(jìn)行脫細(xì)胞處理，SDS可以溶解細(xì)胞膜和核膜[19]，而胰蛋白酶主要作用于精氨酸和賴氨酸C端的多肽鍵[20]，在兩者的共同作用下可使細(xì)胞有效地裂解并將細(xì)胞碎片洗出。在組織的預(yù)處理中，可以提前通過反復(fù)凍融法破壞細(xì)胞，將組織置于低溫條件下（-20 ℃～-80 ℃），使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，由于細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起細(xì)胞溶脹，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎[21]。

需要注意的是，脫細(xì)胞基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白，在未變性條件下，膠原蛋白對(duì)胰蛋白酶具有抗性，但是當(dāng)膠原蛋白發(fā)生變性后，其原有的三螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)解旋，α-鏈易被蛋白酶酶解成肽段，膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞[22]。因此在脫細(xì)胞過程中，應(yīng)該嚴(yán)格控制環(huán)境溫度和洗脫劑處理時(shí)間等因素。

3 脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的改性

與哺乳動(dòng)物相比，脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差，水產(chǎn)膠原蛋白的變性溫度普遍低于哺乳動(dòng)物膠原蛋白[23]，這與它們自身的溫度及所處生活環(huán)境有著密切關(guān)系[24]，在正常人體體溫條件下（37 ℃）也會(huì)發(fā)生變性，因此，必須通過技術(shù)手段提高脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的穩(wěn)定性。常用方法是交聯(lián)法，包括化學(xué)法、物理法和酶法交聯(lián)。

3.1 化學(xué)法交聯(lián)

化學(xué)法交聯(lián)是依靠化學(xué)交聯(lián)劑與膠原的相互作用，在膠原纖維間和膠原纖維內(nèi)引入外源性交聯(lián)[25]。常用的化學(xué)交聯(lián)劑包括戊二醛（GTA）、碳化二亞胺（EDAC）、疊氮二苯基磷（DPPA）等。需要注意的是，化學(xué)法交聯(lián)雖然能夠提高基質(zhì)的穩(wěn)定性，但是必須考慮交聯(lián)劑在人體內(nèi)的降解速率，即交聯(lián)劑的選擇、交聯(lián)的時(shí)間和交聯(lián)劑的濃度問題。近年來，有學(xué)者利用京尼平（Genipin）與膠原[26]、明膠、殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，交聯(lián)效果較好；京尼平的毒性遠(yuǎn)低于戊二醛和其他常用的化學(xué)交聯(lián)劑。此外，某些天然交聯(lián)劑因?yàn)槠涠拘暂^低、交聯(lián)效果好等特點(diǎn)得到廣泛研究。Tan等[27]利用雙醛羧甲基纖維素鈉（DCMC）與膠原交聯(lián)制作膠原海綿，膠原的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能明顯提高。

3.2 物理法交聯(lián)

物理法如電離輻射、紫外線照射等，X射線能夠在相鄰膠原纖維之間產(chǎn)生熱穩(wěn)定的分子間交聯(lián)[28]，紫外線能與核黃素等光敏劑結(jié)合，在膠原纖維內(nèi)和膠原纖維間形成羰基共價(jià)鍵[29]。與化學(xué)法交聯(lián)相比，物理法交聯(lián)能夠避免引入有毒化學(xué)物質(zhì)，但是過程中溫度的升高會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。Davidenko等[30]利用紫外線對(duì)牛膠原進(jìn)行交聯(lián)，過程中引入葡萄糖來提高交聯(lián)效果，同時(shí)防止膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)解旋，交聯(lián)后的膠原蛋白三維結(jié)構(gòu)得到較好保留，穩(wěn)定性也有顯著提高。

3.3 酶法交聯(lián)

酶法交聯(lián)一般是利用酶的特異性催化，如賴氨酸氧化酶能夠特異性地催化膠原分子N端和C端末端肽區(qū)的賴氨酸/羥賴氨酸修飾成α-氨基己二酸半醛。這些新形成的醛與未修飾的賴氨酸或羥賴氨酸殘基縮合形成交聯(lián)[31]。常用的酶還包括谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，它通過催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，谷氨酰胺殘基的g-甲酰胺基團(tuán)作為?；w，賴氨酸殘基的e-氨基基團(tuán)起?；荏w作用。通過酰胺鏈與賴氨酸和谷氨酰胺殘基的側(cè)鏈實(shí)現(xiàn)交聯(lián)[32]。Nicolas等[33]證明，用轉(zhuǎn)肽酶SortaseA交聯(lián)得到的水凝膠細(xì)胞相容性較好，安全性較高。

4 脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的優(yōu)勢

4.1 生物相容性好

脫細(xì)胞組織的主要成分為膠原蛋白，而膠原蛋白具有免疫原性低[34]、生物降解性好[35]等特點(diǎn)，曾經(jīng)被認(rèn)為是一種無抗原性的生物材料[36]。近年來，隨著基因工程技術(shù)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白非螺旋末端區(qū)的端肽會(huì)引起一定免疫原性[37]，而脫細(xì)胞過程中加入胰蛋白酶可以有效地去除端肽，降低膠原蛋白本身的免疫原性。經(jīng)過脫細(xì)胞處理的魚皮不含細(xì)胞，一般通過H&E染色和Masson染色[38]判斷有無細(xì)胞核殘留以及膠原纖維和肌原纖維的含量。

4.2 生物降解性強(qiáng)

Baldursson等[4]對(duì)比豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)和脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)在全層皮膚損傷治療時(shí)的愈合速率及生物安全性，采用酶聯(lián)免疫（ELISA）法分析抗核抗體（ANA）、抗鹽水可提取性抗原多肽抗體譜（ENA）、抗雙鏈DNA抗體（DSDNA）和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）等。結(jié)果表明：脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的愈合速度更快，術(shù)后28 d傷口完全閉合，生物相容性更好，過程中沒有發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的良好抗炎性可能與魚皮中富含Ω-3等不飽和脂肪酸有關(guān)。Ω-3脂肪酸能夠刺激巨噬細(xì)胞，通過抑制NLRP3炎癥小體的活化來預(yù)防炎癥和代謝紊亂[4]。

4.3 三維結(jié)構(gòu)更利于細(xì)胞的遷移與增殖

相比于豬、羊、牛皮，魚皮的網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)有著不同的編織方式，前者的網(wǎng)狀層編織是立體三維，方向基本均一，而魚皮各個(gè)網(wǎng)狀單元層呈平面二維編織形式，各個(gè)網(wǎng)狀單元相互疊加，其間主要靠一些縱向細(xì)小的膠原纖維束連接[18]。體外試驗(yàn)表明，魚皮脫細(xì)胞基質(zhì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比豬或牛皮脫細(xì)胞基質(zhì)更利于細(xì)胞的遷移與增殖，可促進(jìn)血管的再生[39]。

4.4 排除人畜共患病威脅

哺乳動(dòng)物傳染性疾病多發(fā)，魚類特殊的生存環(huán)境和魚皮特有的防護(hù)機(jī)理，人畜共患病的傳播風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物。魚皮中可能存在寄生蟲等危險(xiǎn)，但脫細(xì)胞過程中pH的變化，及脫細(xì)胞產(chǎn)品常用的環(huán)氧乙烷滅菌處理，能夠得到有效去除。

4.5 規(guī)避宗教問題

在某些特殊地區(qū)，因?yàn)樽诮绦叛龅纫蛩?，不能使用豬或牛組織提取的膠原蛋白[40]，限制了脫細(xì)胞豬皮、牛皮基質(zhì)在這些地區(qū)的臨床應(yīng)用。而脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)則沒有這些困擾，這也是近年來提倡使用魚皮膠原蛋白來替代傳統(tǒng)的豬皮或牛皮膠原蛋白的原因。

4.6 水產(chǎn)資源豐富

我國的海岸線總長達(dá)3.2萬余 km，具有豐富的水產(chǎn)資源。近年來，國家在不斷強(qiáng)調(diào)對(duì)海洋資源的合理開發(fā)和利用，提倡中國應(yīng)該堅(jiān)持走依海富國、以海強(qiáng)國、人海和諧、合作共贏的發(fā)展道路[41]。魚皮作為水產(chǎn)加工副產(chǎn)物，一直以來利用率較低。若用脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)替代脫細(xì)胞豬皮/牛皮基質(zhì)，應(yīng)用于組織修復(fù)和整容整形行業(yè)，將進(jìn)一步提高水產(chǎn)資源利用率。

5 脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的臨床應(yīng)用

最早的脫細(xì)胞魚皮產(chǎn)品是美國FDA于2013年批準(zhǔn)的KerecisTM，主要用于慢性潰瘍創(chuàng)面治療。該產(chǎn)品在結(jié)構(gòu)上與脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)和脫細(xì)胞豬皮基質(zhì)相似，但是，在魚皮的前處理階段保留了真皮層中的脂肪，因?yàn)轸~皮脂肪中含有豐富的Ω-3等不飽和脂肪酸，有利于降低炎癥反應(yīng)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域轉(zhuǎn)移[42]。Yang等[42]對(duì)KerecisTM的治療效果進(jìn)行測試，結(jié)果表明在慢性潰瘍創(chuàng)面治療中，KerecisTM表現(xiàn)出優(yōu)良的修復(fù)效果，患者使用KerecisTM5周后，創(chuàng)面面積減少40%，創(chuàng)面深度減少48%。此后，深入研究了脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)。Magnússon等[43]選用大西洋鱈魚（Gadus morhua）魚皮制作脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)，用于糖尿病等慢性潰瘍的再生修復(fù)。Kjartansson等[44]探究KerecisTM對(duì)硬腦膜缺損的修復(fù)作用。王園園等[18]選用沙鰻魚皮制作脫細(xì)胞基質(zhì)，用于口腔醫(yī)學(xué)中組織修復(fù)。

6 脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)制備中存在的問題

脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)作為一種新型生物支架材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，在產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)中，必須注意幾個(gè)問題。

6.1 魚皮種類的選擇

不同種類的魚皮在結(jié)構(gòu)上存在差異，理想的脫細(xì)胞魚皮材料應(yīng)該具有雙層結(jié)構(gòu)，一面光滑、一面疏松多孔，有利于細(xì)胞的遷移和黏附。而有些魚皮材料（如黑魚Channa argus）呈現(xiàn)出平滑結(jié)構(gòu)，在電鏡觀察下，兩面均無孔隙結(jié)構(gòu)[38]，不利于細(xì)胞的遷移和生長。常用的脫細(xì)胞魚皮來源包括鱈魚（Gadus）、馬面魚（Thamnaconus septentrionalis）和沙鰻魚。

6.2 季節(jié)對(duì)于魚皮性質(zhì)的影響

Duan等[45]研究發(fā)現(xiàn)，捕撈的季節(jié)對(duì)鯉魚（Cyprinus carpio）魚皮明膠的理化性質(zhì)（氨基酸組成）和流變學(xué)特性（黏度特性、凝膠強(qiáng)度和熔點(diǎn)）會(huì)產(chǎn)生一定影響，夏季魚皮明膠的穩(wěn)定性明顯高于冬季。因此，為了保證脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的性質(zhì)穩(wěn)定，選用魚皮來源及捕撈時(shí)間需要合理的規(guī)劃。

6.3 交聯(lián)方法和交聯(lián)劑的選擇

魚皮膠原蛋白的變性溫度一般低于37 ℃，在臨床應(yīng)用中容易發(fā)生熱變性。可以通過交聯(lián)來提高脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性。最常用的化學(xué)交聯(lián)法交聯(lián)效果較好，但會(huì)引入外來有害物質(zhì)，必須考慮交聯(lián)劑在人體內(nèi)的降解速率。

6.4 皮下脂肪的保留

不同于哺乳動(dòng)物皮膚，魚皮中含有豐富的不飽和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能夠一定程度抑制炎癥發(fā)生，因此在脫細(xì)胞前處理中，可以選擇性地保留真皮層中的脂肪。

7 結(jié)語與展望

近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和動(dòng)物福利的改善，魚類在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，常被用作為陸生哺乳動(dòng)物的替代模型[46]。除研究魚皮脫細(xì)胞外，國外學(xué)者還對(duì)魚體其他部位的生物學(xué)功能進(jìn)行探討。如Kumar等[47]討論脫細(xì)胞魚鰾基質(zhì)在皮膚創(chuàng)面愈合修復(fù)中的應(yīng)用前景。相比于國外相對(duì)成熟的脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)制作工藝和評(píng)價(jià)體系，我國對(duì)于脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的研究才剛剛起步，相關(guān)文獻(xiàn)也較少。王園園等[18]提出一種利用沙鰻魚皮制作脫細(xì)胞基質(zhì)的新工藝，作為引導(dǎo)組織修復(fù)膜應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)中。祖麗皮也·阿不力克木等[38]探究了馬面魚、黑魚、沙鰻魚（Astroconger Myriaster）、鯉魚和鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）魚皮制成的脫細(xì)胞基質(zhì)的理化特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬面魚脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)具有多孔孔隙結(jié)構(gòu)，更接近理想的組織工程支架材料，利用魚皮制備脫細(xì)胞基質(zhì)可行，也完善了脫細(xì)胞魚皮的制備方法。但是，對(duì)于脫細(xì)胞魚皮基質(zhì)的改性及如何保證規(guī)?；a(chǎn)時(shí)產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，仍需要進(jìn)一步研究與探討。