小鼠脂肪沉積過程中定量PCR內(nèi)參基因的篩選

華永琳，熊 燕,*，張 靜,，郭 玉,，秦文昌，熊顯榮，字向東，殷 實(shí)，李 鍵,*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

脂肪組織的過度沉積是導(dǎo)致小動(dòng)物肥胖的關(guān)鍵因素，該生物學(xué)過程受到大量基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控。伴隨著肥胖的產(chǎn)生，機(jī)體和組織水平的炎癥細(xì)胞和炎癥因子大量產(chǎn)生，多種慢性疾病作為肥胖的并發(fā)癥出現(xiàn)，產(chǎn)生復(fù)雜的病理狀態(tài)。小鼠作為模式動(dòng)物，基因改造相對(duì)容易且脂肪組織沉積特征明顯，主要有腹股溝白色脂肪組織(inguinal white adipose tissue,iWAT)、附睪白色脂肪組織(epidydimal white adipose tissue,eWAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)等，是動(dòng)物脂肪沉積基因功能活體研究的理想材料。在基因功能研究中，RNA水平的調(diào)控是基因調(diào)控極其重要的一個(gè)層面。目前基于qRT-PCR的相對(duì)定量分析是檢測(cè)RNA表達(dá)水平應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，但不同的內(nèi)參基因可能導(dǎo)致的定量結(jié)果差異較大，偏離體內(nèi)基因表達(dá)的真實(shí)水平，因此選擇穩(wěn)定的內(nèi)參是基因相對(duì)定量分析的關(guān)鍵[1]。

脂肪組織常用內(nèi)參基因包括β2-微球蛋白(B2M)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、親環(huán)蛋白A(PPIA)、琥珀酸脫氫酶復(fù)合物亞單位A(SDHA)等基因。近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同組織和細(xì)胞類型、細(xì)胞增殖分化不同階段、體外培養(yǎng)等情況下這些內(nèi)參基因的表達(dá)量通常變異較大[2]。YAN等[3]發(fā)現(xiàn)，RPL13a和YWHAZ組合可作為小鼠急性胰腺炎模型中的最佳內(nèi)參基因；而DESSELS等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮FBS誘導(dǎo)的脂肪來源的基質(zhì)細(xì)胞中，RPL13a是表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。此外，在C57BL/6J和C3H/HeJ等2個(gè)品系小鼠的下丘腦、垂體和卵巢中，Gapdh和HPRT1表達(dá)最為穩(wěn)定[5]；而GU等[6]發(fā)現(xiàn)，在小鼠早期胚胎、妊娠期胎盤中Gapdh和β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性較差。小鼠脂肪組織及細(xì)胞是研究動(dòng)物體內(nèi)外脂肪沉積較好的模型，但其qRT-PCR相對(duì)定量研究的內(nèi)參基因還存在爭(zhēng)議。據(jù)報(bào)道，ACTB是肌內(nèi)脂肪成脂分化過程中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[7]，但也有研究顯示ACTB不適合作內(nèi)參基因。

因此，本試驗(yàn)以小鼠iWAT、eWAT和BAT為試驗(yàn)材料，采用qRT-PCR方法檢測(cè)不同類型脂肪組織、白色和棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Gapdh、PPIA、18S rRNA、β-tubulin、β-actin、SDHA、UBC、ACTB和RPL13a等9個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平，并利用RefFinder程序(geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt)進(jìn)行綜合分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期獲得小鼠脂肪沉積過程中的最優(yōu)內(nèi)參，為后期關(guān)于小鼠脂肪沉積過程中RNA定量研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物本試驗(yàn)所需昆明小鼠(n=10)購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于西南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，7:00-19:00光照，19:00-07:00黑暗，自由采食，溫度控制在25℃左右。將1～2月齡雄性昆明小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精消毒處理后分別采集3種類型脂肪組織于RNA-free的EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1小鼠前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將采集的脂肪組織置于盛有PBS(含1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，清洗干凈后用滅菌剪刀剪碎，加入適量Ⅰ型膠原酶，于恒溫振蕩水浴鍋37℃消化30～60 min。消化完成后加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后離心接種于12孔板，第2天換液，以后每2 d 換1次培養(yǎng)液，至細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，換誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)4 d，之后換分化液繼續(xù)培養(yǎng)，并于誘導(dǎo)后0,2,4,6,8 d收集細(xì)胞，每個(gè)樣品收集3個(gè)重復(fù)。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成 Trizol法提取小鼠脂肪組織及脂肪細(xì)胞的總RNA，利用核酸濃度分析儀測(cè)定RNA濃度和純度，其中將D260/D280比值為1.9～2.1的樣品按照 TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一條鏈，-20℃保存。

1.2.3引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 根據(jù)各基因在脂肪沉積中的研究進(jìn)展以及前人研究[8]，本試驗(yàn)選取9個(gè)內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank中的登錄序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。將1.2.2中小鼠脂肪組織cDNA按5倍稀釋，選取5-1～5-4稀釋倍數(shù)的樣品進(jìn)行qRT-PCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 9個(gè)候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR qRT-PCR通過BIO-RAD CFX connect real-time system運(yùn)行，具體反應(yīng)程序及步驟參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.5內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性通過RefFinder程序進(jìn)行分析。將所有候選基因qRT-PCR的循環(huán)閾值(Ct)減去最小Ct值，得到ΔCt，并轉(zhuǎn)換為相對(duì)表達(dá)量。geNorm程序通過計(jì)算2-ΔCt值測(cè)定基因表達(dá)穩(wěn)定性(M值)大小(M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定)，從而判斷最穩(wěn)定及最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。當(dāng)M>1.5時(shí)，該基因不適合作為內(nèi)參[10]。NormFinder與geNorm計(jì)算原理相似，根據(jù)所有候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值的大小篩選出穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因[11]。BestKeeper則根據(jù)Ct值的幾何平均數(shù)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，s)、變異系數(shù)(soefficient of variation，CV)、相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，R2)，根據(jù)s、CV值的大小判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[12]。ΔCt法[13]根據(jù)各內(nèi)參基因的平均標(biāo)準(zhǔn)差(s)評(píng)估基因表達(dá)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參基因引物的特異性及擴(kuò)增效率對(duì)PPIA等9個(gè)內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，qRT-PCR熔解曲線顯示，每一個(gè)內(nèi)參基因擴(kuò)增均表現(xiàn)為單個(gè)產(chǎn)物的峰值，沒有非特異性擴(kuò)增(圖1)[14]，同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估引物效率。結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R2為0.894 5 ～1.000 0，PCR擴(kuò)增效率E為 0.75～1.16(表2),表明內(nèi)參基因的引物特異性好、擴(kuò)增效率符合要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。此外，通過分析上述組織及細(xì)胞中9個(gè)候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct)，發(fā)現(xiàn)PPIA和Ubc的Ct值在iWAT、eWAT和BAT中都比較穩(wěn)定，而18S rRNA、ACTB和Gapdh的Ct值變化較大；在白色脂肪細(xì)胞分化過程中SDHA、18S rRNA、PPIA、Gapdh的Ct值較穩(wěn)定，而在棕色脂肪細(xì)胞中Ubc、RPL13a、PPIA的Ct值較穩(wěn)定(圖2)。

2.2 小鼠脂肪沉積過程中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估本試驗(yàn)利用geNorm、Normfinder、Bestkeeper以及ΔCt等方法對(duì)其進(jìn)行分析，最終推薦出適合小鼠脂肪沉積的最佳內(nèi)參基因[15]。geNorm對(duì)所有樣品的 2-ΔCt值分析顯示在小鼠3種不同類型脂肪組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序依次為β-tubulin=RPL13a、Ubc、PPIA、β-actin、SDHA、Gapdh、ACTB、18S rRNA，其中最穩(wěn)定的是β-tubulin和RPL13a，穩(wěn)定值為0.457，其次為Ubc，最不穩(wěn)定的是18S rRNA。同時(shí)在小鼠脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因也是β-tubulin，而傳統(tǒng)內(nèi)參基因Gapdh、ACTB以及SDHA在小鼠脂肪沉積過程中表達(dá)不穩(wěn)定(圖3)。

圖1 小鼠脂肪組織中 9 個(gè)候選內(nèi)參基因的 Real-time PCR 熔解曲線 A.PPIA;B.β-tubulin;C.β-actin;D.18S rRNA;E.ACTB;F.SDHA;G.Gapdh;H.Ubc;I.RPL13α

表2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)(R2)及擴(kuò)增效率(E)

圖2 小鼠脂肪組織及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中9個(gè)候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值 A.1～2月齡小鼠的不同類型脂肪組織(iWAT、eWAT、BAT)中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值；B.小鼠白色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值；C.小鼠棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值

圖3 geNorm分析小鼠不同類型脂肪組織及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

NormFinder程序分析發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中RPL13a基因排名第一，β-tubulin次之，18S rRNA排名最后，穩(wěn)定值達(dá)到8.888。而在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定，其次為β-tubulin，RPL13a基因的穩(wěn)定性介于所選9個(gè)內(nèi)參基因的中間(表3)。BestKeeper分析得出小鼠脂肪組織中9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序?yàn)椋?8S rRNA>PPIA>β-actin>Ubc>RPL13α>β-tubulin>ACTB>Gapdh>SDHA(表4)。小鼠脂肪細(xì)胞分化過程中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)镽PL13α、PPIA、Ubc、18S rRNA、SDHA、β-tubulin、β-actin、Gapdh、ACTB(表5)。此外通過比較Ct法發(fā)現(xiàn)在小鼠不同類型脂肪組織中RPL13α表達(dá)最穩(wěn)定，接下來依次為β-tubulin、Ubc、β-actin、PPIA、Gapdh、SDHA和ACTB，最不穩(wěn)定的是18S rRNA，而在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中18S rRNA表達(dá)最為穩(wěn)定(表4，5)。

表3 利用 NormFinder 程序分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

RefFinder程序最終分析出在小鼠不同類型脂肪組織中排名前3位的內(nèi)參基因分別是RPL13α、β-tubulin、Ubc，其中RPL13α和ACTB是最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表4)。在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定，ACTB也是表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表5)。因此，在研究小鼠脂肪沉積過程中ACTB并不適合作為內(nèi)參基因。

表4 RefFinder程序分析小鼠脂肪組織中候選 內(nèi)參基因的穩(wěn)定值

表5 RefFinder程序分析小鼠脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值

2.3 脂肪組織中內(nèi)參基因的表達(dá)驗(yàn)證為驗(yàn)證已篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因的可靠性，以脂肪組織最穩(wěn)定的RPL13a基因及最不穩(wěn)定的ACTB為內(nèi)參基因，用qPCR方法分析目的基因KDM2A在不同類型脂肪組織的表達(dá)。結(jié)果顯示，以RPL13α 為內(nèi)參時(shí)，KDM2A在eWAT中具有較高的表達(dá)量，BAT次之(圖4A)；而以ACTB為內(nèi)參基因時(shí)，KDM2A在BAT中表達(dá)量最高，在eWAT中表達(dá)量最低(圖4B)，進(jìn)一步通過絕對(duì)定量發(fā)現(xiàn)KDM2A在不同類型脂肪組織的表達(dá)模式與以RPL13a為內(nèi)參基因的相對(duì)定量結(jié)果一致(圖4C)，表明通過上述方法分析獲得的穩(wěn)定內(nèi)參基因可靠，可廣泛作為不同類型脂肪組織基因相對(duì)定量表達(dá)的內(nèi)參基因。

圖4 小鼠不同類型脂肪組織中內(nèi)參基因的表達(dá)驗(yàn)證 A.RPL13α為內(nèi)參基因時(shí)KDM2A的相對(duì)表達(dá)量；B.ACTB為內(nèi)參基因時(shí)KDM2A的相對(duì)表達(dá)量；C.絕對(duì)定量結(jié)果

3 討論

qRT-PCR是基因表達(dá)相對(duì)定量的常用方法，合適的內(nèi)參基因是獲得可靠試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵[16-17]。研究表明，沒有一種內(nèi)參基因可在所有條件下被普遍使用[18]。在以往的相關(guān)研究中，由于Gapdh和ACTB在所有組織細(xì)胞中高表達(dá)且表達(dá)量恒定[19]，常被用作內(nèi)參基因。然而在人類肥胖相關(guān)研究中，CATALAN等[20]證明Gapdh是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。GENTILE等[21]研究發(fā)現(xiàn)，RPL13α是人脂肪細(xì)胞分化過程中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這與本試驗(yàn)篩選出的小鼠脂肪組織中最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因RPL13α的結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)通過多種程序分析9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示RPL13α和18S rRNA分別是小鼠不同類型脂肪組織及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。PPIA、SDHA、ACTB、Gapdh等不適合作為小鼠脂肪沉積的內(nèi)參基因，可能是由于這些基因在脂肪組織沉積或者脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PPIA是一種在肥胖中發(fā)揮重要作用的新型脂肪因子，正向調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及機(jī)體脂肪組織的沉積[22]。有研究表明，ACTB的表達(dá)受細(xì)胞有絲分裂原的刺激[23]，前體脂肪細(xì)胞分化感受誘導(dǎo)信號(hào)，首先發(fā)生細(xì)胞克隆增殖，該過程中ACTB的表達(dá)上調(diào)[24]，因此ACTB也不適合作為脂肪沉積基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。本研究發(fā)現(xiàn)Gapdh在脂肪組織及脂肪細(xì)胞分化過程中均不適合作為內(nèi)參基因，Gapdh 是能量代謝過程中的重要激酶[25]，白色與棕色脂肪組織或細(xì)胞能量代謝過程差異較大[26]，因此不適合作為脂肪組織沉積的內(nèi)參基因。

組蛋白特異性去甲基化酶KDM2A與KDM2B同屬KDM2亞家族，KDM2B參與3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化早期階段，而KDM2A對(duì)小鼠脂肪沉積的作用尚未見報(bào)道[27]。因此，本試驗(yàn)運(yùn)用RPL13α為內(nèi)參基因來校正目標(biāo)基因KDM2A在不同類型脂肪組織中的表達(dá)以及絕對(duì)定量計(jì)算每個(gè)樣品中的實(shí)際拷貝數(shù)，為后期繼續(xù)探究KDM2A基因在小鼠脂肪沉積過程中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。校正結(jié)果顯示， KDM2A基因在eWAT中表達(dá)量最高，其次為BAT，而在iWAT中表達(dá)量最低，而以ACTB作內(nèi)參基因時(shí)，KDM2A基因高表達(dá)于BAT，在eWAT中表達(dá)量最低。以上結(jié)果表明，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)NA定量表達(dá)的研究具有至關(guān)重要的作用。

綜上所述，本試驗(yàn)成功篩選出了小鼠3種不同類型脂肪組織及白色和棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，分別為RPL13α和18S rRNA，并以RPL13α、ACTB為內(nèi)參基因以及絕對(duì)定量來驗(yàn)證KDM2A基因在腹股溝白色脂肪組織、附睪白色脂肪組織和棕色脂肪組織中的表達(dá)，為小鼠脂肪沉積過程中基因功能的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)參考。