綿羊弓形蟲病垂直傳播研究進(jìn)展

姜 楠,楊玉榮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種全世界普遍存在的機(jī)會性致病原蟲，可感染幾乎所有恒溫動物的有核細(xì)胞，包括家畜和人類[1]。感染弓形蟲是獲得性免疫缺陷綜合征患者死亡的主要原因之一[2-3]。弓形蟲的傳播途徑包括水平傳播和垂直傳播。恒溫動物可經(jīng)攝入弓形蟲卵囊污染的水果、蔬菜或水；輸入含弓形蟲速殖子的血液；攝入含速殖子的奶和奶酪；食用未煮熟的含有弓形蟲包囊的肉品而水平感染。弓形蟲速殖子可經(jīng)母體胎盤或精液垂直傳播[1]。母體感染弓形蟲，蟲體不僅在宿主細(xì)胞內(nèi)生長、繁殖，還會通過胎盤、乳汁傳染給后代，先天性感染的后代可能會發(fā)生流產(chǎn)、死胎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、腦積水、顱內(nèi)鈣化[1,4-5]和間質(zhì)性肺炎[6]。牛對弓形蟲感染有一定的抵抗能力，而綿羊是弓形蟲的易感宿主，弓形蟲病是綿羊流產(chǎn)的主要的原因之一[7]。此外，根據(jù)綿羊弓形蟲病流行病學(xué)特點(diǎn)，推測其呈現(xiàn)的弓形蟲病高陽性率可能主要是內(nèi)源性包囊激活傳播途徑，而不是外源性經(jīng)卵囊傳播途徑[8]。

目前，對綿羊弓形蟲病垂直傳播的情況報(bào)道尚少。本研究就綿羊弓形蟲病垂直傳播情況、感染形式、致病特點(diǎn)以及防控進(jìn)行綜述，為了解綿羊弓形蟲病垂直傳播情況提供參考依據(jù)，為有效防控弓形蟲對綿羊生殖健康的影響保障綿羊產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 綿羊弓形蟲病流行病學(xué)

1.1 綿羊弓形蟲病流行病學(xué)及風(fēng)險(xiǎn)因子世界范圍內(nèi)，山羊和綿羊廣泛感染弓形蟲，已從羊肉、羊奶和羊奶制成的奶酪中分離到活的弓形蟲蟲株[9-10]。血清學(xué)方法廣泛用于弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查研究。目前，全世界約有140項(xiàng)研究對綿羊弓形蟲病血清流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查研究，其陽性率為3%～96%[1]。我國約有50項(xiàng)關(guān)于綿羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查研究，其陽性率為1%～39%[11-12]。世界范圍綿羊弓形蟲病感染率表現(xiàn)為大洋洲>北美洲>歐洲>亞洲>南美>非洲，中國的綿羊弓形蟲病感染率(11.8%)低于亞洲(33.9%)平均水平(表1)，可能與我國畜牧業(yè)集約化程度高和飲食習(xí)慣有關(guān)。不同地區(qū)的綿羊弓形蟲病陽性率有差異，主要與貓的分布和數(shù)量、溫暖潮濕的氣候、流產(chǎn)史、海拔高度、綿羊的年齡、水源和降水量、集約化程度、放牧的密度、飼料類型、管理措施和周邊環(huán)境有關(guān)[12]。

表1 綿羊弓形蟲病流行病學(xué)及風(fēng)險(xiǎn)因子

1.2 不同綿羊種群弓形蟲病感染率與流產(chǎn)率差異綿羊弓形蟲病陽性率因種群不同而有差異。一般認(rèn)為，綿羊弓形蟲病主要是經(jīng)攝入弓形蟲卵囊途徑感染，草食動物采食含弓形蟲包囊的可能性比較小。但研究結(jié)果顯示，位于同一地區(qū)的同一品種不同家族綿羊的弓形蟲病，呈不平均分布，且差異較大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲感染和流產(chǎn)在家族之間不呈現(xiàn)隨機(jī)分布，而與家族流產(chǎn)率呈顯著相關(guān)，因此推測除卵囊途徑以外，內(nèi)源性垂直傳播可能在綿羊弓形蟲病傳播過程占有一定的比例[14]。此外，如果卵囊是弓形蟲病主要感染來源，那么不同動物的感染率是接近的，且隨年齡增長感染率增高，然而流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)綿羊弓形蟲感染率明顯高于其他動物[15]，這種差異說明綿羊弓形蟲病的傳播可能還有其他的替代機(jī)制。

1.3 流產(chǎn)胎兒的弓形蟲病流行病學(xué)衣原體、布魯菌、沙門菌和弓形蟲等病原均是引起綿羊流產(chǎn)的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，懷孕母羊因感染弓形蟲病而引起流產(chǎn)、死胎的數(shù)量，占全部流產(chǎn)母羊的20%[1]，經(jīng)濟(jì)損失巨大。2 000個(gè)弓形蟲卵囊可引起母羊流產(chǎn)[16]。90%的流產(chǎn)胎兒組織(大腦、心臟、肺臟、肝臟、舌)可檢測到弓形蟲DNA，明顯高于活胎兒(臍帶)的弓形蟲陽性率(46%)，說明弓形蟲與流產(chǎn)密切相關(guān)[17]。PEREIRA等[18]對流產(chǎn)胎兒進(jìn)行了廣泛的調(diào)查，23%(n=173)的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)有弓形蟲或弓形蟲DNA。MASALA等[19]對流產(chǎn)綿羊的胎盤和胎兒組織進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)弓形蟲為最常見的病原，從流產(chǎn)胎兒的肌肉、肝臟、胃、脾臟、大腦和胎盤均可檢出弓形蟲DNA，11%的胎兒(n=2 471)組織中發(fā)現(xiàn)弓形蟲DNA，其中胎盤的陽性率最高(32%)，其次是肌肉和大腦；另外的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，18%的流產(chǎn)胎兒和13%的胎盤(n=366)檢測到弓形蟲DNA[20]，從而推測弓形蟲病與綿羊流產(chǎn)密切相關(guān)。DUNCANSON等[21]從綿羊胎盤組織、胎兒大腦和心臟組織中檢測到弓形蟲DNA(61%，54/88)，其中流產(chǎn)綿羊的弓形蟲陽性率(94%，17/18)明顯高于非流產(chǎn)綿羊(42%，37/70)，推測弓形蟲垂直傳播是影響綿羊生殖健康的重要因素。HURTADO等[22]對流產(chǎn)綿羊調(diào)查發(fā)現(xiàn)，19%的流產(chǎn)胎兒和死胎(n=53)可檢出弓形蟲DNA，胎兒的大腦、脾臟、肺臟、胎盤、肝臟、腎臟和胎兒體液均可檢出弓形蟲DNA，其中大腦的陽性率最高。HIDE等[8,23]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊弓形蟲病垂直傳播發(fā)生的比例很高，可達(dá)69%，并推測母羊弓形蟲病垂直傳播的感染途徑可能主要是內(nèi)源性包囊激活傳播途徑。

1.4 關(guān)于是否根據(jù)弓形蟲感染史選擇后備母羊的爭論關(guān)于是否選用弓形蟲感染史綿羊作為后備母羊，有兩種觀點(diǎn)。弓形蟲慢性感染小鼠可發(fā)生高比例的先天性弓形蟲感染[24]，而弓形蟲慢性感染大鼠僅發(fā)生低比例的先天性弓形蟲感染[25]。但關(guān)于弓形蟲慢性感染綿羊的情況，還不明確。新西蘭、法國和英國綿羊廣泛使用的S48株弓形蟲速殖子活疫苗，一般在配種前3周注射，可有效防控綿羊弓形蟲病引起的流產(chǎn)[26]。綿羊配種前8周口服感染弓形蟲卵囊(大于200個(gè))，能在一定程度防御妊娠中期弓形蟲感染而引起的流產(chǎn)[27]。這些報(bào)道推測綿羊感染弓形蟲可獲得終生性免疫，選擇慢性弓形蟲病母羊繁殖后代，可在一定程度上降低因弓形蟲感染而引起的流產(chǎn)率。然而，MORLEY等[28]研究發(fā)現(xiàn)因感染弓形蟲而流產(chǎn)的母羊，在后續(xù)妊娠過程中有55%的母羊連續(xù)發(fā)生因弓形蟲引起的流產(chǎn)，弓形蟲抗體不能有效防御先天性弓形蟲病。CHIEBAO等[29]也發(fā)現(xiàn)，妊娠期慢性弓形蟲病綿羊，可以再感染其他弓形蟲蟲株，說明選用慢性弓形蟲感染期的母羊繁殖，不能有效降低弓形蟲感染而引起的流產(chǎn)。這些觀點(diǎn)的差異，可能與綿羊品系、家族、妊娠期、弓形蟲基因型和蟲株、感染途徑等有關(guān)系，還需要鑒定感染蟲株的基因型來進(jìn)一步研究。

1.5 感染綿羊弓形蟲蟲株的基因型關(guān)于自然發(fā)生的綿羊弓形蟲垂直傳播的基因型，還未見報(bào)道。我們總結(jié)了全世界和我國綿羊弓形蟲流行的主要基因型。目前，從綿羊分離到的蟲株主要是ToxoDB#1和ToxoDB#3型弓形蟲(Ⅱ型)，其次是ToxoDB#2(Ⅲ型)[1,30-31]。從我國綿羊組織共分離得到14株弓形蟲，其中有1株為ToxoDB#1或ToxoDB#3[32]，有2株是ToxoDB#9[11]，有7株為ToxoDB#2[33]，有4株為ToxoDB#4[33]。全基因組測序證明ToxoDB#4和ToxoDB#9屬于Ⅱ型弓形蟲的同一分支[34]。

2 弓形蟲引起綿羊流產(chǎn)的影響因素及對傳播機(jī)制的初步研究

2.1 綿羊不同妊娠期感染弓形蟲對傳播效率和胎兒的影響綿羊弓形蟲垂直傳播途徑包括內(nèi)源性速殖子或活化的包囊經(jīng)胎盤傳播、外源性卵囊經(jīng)胎盤傳播和速殖子經(jīng)乳汁傳播[35-36]。大多數(shù)綿羊出生后經(jīng)弓形蟲卵囊途徑感染弓形蟲，但在綿羊孕期初次感染弓形蟲，可引發(fā)弓形蟲從母代傳遞到子代，約占綿羊弓形蟲總感染率的4%[36]。牛對犬新孢子蟲易感，新孢子蟲病垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)與孕期有關(guān)，妊娠中期感染易導(dǎo)致流產(chǎn)，孕晚期感染則可使胎兒獲得免疫力，從而抑制蟲體的增殖，產(chǎn)出臨床上正常的胎兒，但為帶蟲者。與新孢子蟲類似，弓形蟲垂直傳播的效率取決于母羊感染時(shí)的妊娠期，其傳播效率在妊娠早期最低，在妊娠晚期最高。而弓形蟲對妊娠早期的胎兒影響最大，常引起胚胎死亡、吸收、木乃伊胎和停止發(fā)育，導(dǎo)致母羊不育[37]。母羊妊娠中期感染弓形蟲，87%的母羊流產(chǎn)或分娩死胎[38]，引起胎兒的神經(jīng)病理損傷，且損傷程度重于妊娠后期[39]。妊娠后70 d，胎兒可穩(wěn)定產(chǎn)生抗弓形蟲IgM和IgG抗體，具有一定程度的抗弓形蟲作用[37]。而在懷孕后期感染弓形蟲，母羊通常會產(chǎn)出健康的羔羊或弓形蟲陽性的活胎[36-37,39-40]。弓形蟲可突破胎盤屏障，感染滋養(yǎng)層巨細(xì)胞[41]，但關(guān)于弓形蟲引起綿羊生殖障礙的機(jī)制還不清楚，可能是弓形蟲在胎盤和胎兒體內(nèi)增殖，引起胎盤和胎兒損傷，誘發(fā)胎兒缺氧的直接影響，也可能是弓形蟲感染后引起母羊激素或免疫系統(tǒng)異常而間接引起胎兒發(fā)育停止或流產(chǎn)[40]。

2.2 弓形蟲感染妊娠期綿羊?qū)λ拗髅庖叻磻?yīng)的影響流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，育齡婦女的弓形蟲血清陽性率較高，可能與妊娠期間激素水平的劇烈變化，抑制機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，對弓形蟲更易感有關(guān)系[42-43]。而弓形蟲感染妊娠期宿主，可啟動Th1免疫反應(yīng)的發(fā)生，抑制Th2免疫反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧自由基和一氧化氮等代謝產(chǎn)物。Th1免疫反應(yīng)有利于控制寄生蟲感染，但不利于胎兒存活，而Th2免疫反應(yīng)不能有效控制弓形蟲感染，但可促進(jìn)妊娠的順利進(jìn)行，推測免疫反應(yīng)的變化促進(jìn)了胎盤損傷和流產(chǎn)[44-45]。

2.3 綿羊弓形蟲病慢性感染期弓形蟲的重新激活新孢子蟲慢性感染期的懷孕母牛，新孢子蟲可重新激活，啟動內(nèi)源性跨胎盤傳播，且傳播效率很高，其后代的陽性率可達(dá)95%，而經(jīng)卵囊感染的母牛僅占1.9%[46-47]。弓形蟲慢性感染期可以發(fā)生弓形蟲的內(nèi)源性跨胎盤傳播，但效率低于新孢子蟲[17,48]。關(guān)于弓形蟲慢性感染綿羊垂直傳播的臨床發(fā)生比例，還不明確。已有報(bào)道表明，弓形蟲慢性感染期的孕婦可發(fā)生弓形蟲包囊活化，發(fā)生垂直傳播[49-52]。

胎兒感染弓形蟲可能是母體寄生蟲血癥、胎盤或子宮局部感染弓形蟲所引起的，但也不能排除慢性感染的重新激活[52]。弓形蟲慢性感染期弓形蟲的重新激活可能與調(diào)節(jié)懷孕期間的T細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)[53-54]。慢性弓形蟲感染期，CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，具體表現(xiàn)為凋亡增多、效應(yīng)反應(yīng)降低、淋巴細(xì)胞免疫抑制分子PD-1增多，可促進(jìn)弓形蟲緩殖子向裂殖子轉(zhuǎn)化[55]。弓形蟲慢性感染期(Me 49)Calomys callosus鼠孕期再感染RH蟲株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎盤可檢測到弓形蟲(活蟲株和核酸)，但胚胎未受感染，說明慢性弓形蟲感染對先天性弓形蟲傳播有一定的保護(hù)力，然而胎盤感染的弓形蟲沒有確定是重新激活Me 49，還是再感染的RH蟲株[56]。進(jìn)一步的研究證實(shí)，弓形蟲慢性感染期(Me 49)的Calomys callosus鼠孕期再感染巴西蟲株TgChBrUD1或TgChBrUD2，不僅可以引起Me 49的重新激活，也可以再感染TgChBrUD1 或 TgChBrUD2，并引起不孕、胎兒發(fā)育異常和先天性弓形蟲傳播[57]。弓形蟲慢性感染期孕畜是否會發(fā)生胎兒先天感染弓形蟲，可能與宿主種類、蟲株毒力和懷孕階段有關(guān)系，關(guān)于這方面的研究尚需更多的證據(jù)，以推測其對人類的風(fēng)險(xiǎn)。

3 綿羊弓形蟲病垂直傳播的診斷方法

3.1 母羊弓形蟲病急性期的臨床表現(xiàn)一般認(rèn)為，弓形蟲卵囊的感染效率高于包囊和速殖子。綿羊感染弓形蟲常呈現(xiàn)一過性發(fā)熱和短暫的蟲血癥反應(yīng)[58]，在感染后7～14 d引起妊娠期母羊流產(chǎn)、死胎，少有成年綿羊因感染弓形蟲而死亡的報(bào)道。綿羊灌胃GT-1卵囊，56%的綿羊在感染后6～11 d出現(xiàn)蟲血癥，可持續(xù)1～2 d[59]。免疫力正常的綿羊感染弓形蟲卵囊(M3株)后3～8 d，出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，且發(fā)熱開始的時(shí)間與卵囊數(shù)量呈正相關(guān)，50%的綿羊在感染后2～14 d可檢測到蟲血癥(6～8 d概率最高)[60]。妊娠綿羊灌胃感染弓形蟲卵囊(M4株)后，約在3～11 d有發(fā)熱反應(yīng)，妊娠早期感染弓形蟲可引起明顯的胎盤和胎兒損傷、流產(chǎn)[16,40]。

3.2 綿羊弓形蟲病胎盤及胎兒的特征性病理學(xué)變化及診斷因弓形蟲感染導(dǎo)致母羊流產(chǎn)的胎盤和胎兒的病理變化是：胎盤呈暗紅色，羊水渾濁，有的胎盤自溶，胎兒常表現(xiàn)不同程度的出血、水腫、木乃伊胎和自溶[40]。母體胎盤、胎兒胎盤和胎兒的器官(肝臟和大腦)表現(xiàn)為多個(gè)散在壞死灶[22,39-40]。弓形蟲感染可引起明顯的胎盤子葉和絨毛壞死，壞死灶呈淺黃白色，直徑約3 mm，病變范圍可侵及幾乎所有的子葉[40,61]。顯微鏡下，出現(xiàn)不同程度的壞死性胎盤炎，壞死區(qū)域與相鄰的健康組織有較明顯的界限。壞死表現(xiàn)為凝固性壞死，多位于肉阜和子葉絨毛，有明顯的血栓和梗死，有的壞死灶發(fā)生鈣化，壞死灶周圍浸潤巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，有的可見弓形蟲速殖子[37,40,58]。

研究認(rèn)為，發(fā)熱、免疫反應(yīng)的變化或胎盤局部血液循環(huán)障礙誘發(fā)的胎兒缺血、缺氧性損傷，可能與弓形蟲急性期感染引發(fā)的流產(chǎn)有關(guān)[16,58]。胎兒大腦軟化，大腦、肺臟和肝臟出現(xiàn)典型的血管周圍炎，主要是巨噬細(xì)胞浸潤[40,58]。胎盤、流產(chǎn)胎兒的大腦、肺臟和脾臟的弓形蟲核酸檢出率較高。此外，因母源弓形蟲抗體不能穿過胎盤屏障，胎兒體液弓形蟲抗體可以提示是否感染弓形蟲，然而胎兒胎齡較小(<70胎齡)或感染時(shí)間短(<28 DPI)，胎兒體液弓形蟲抗體會呈陰性反應(yīng)[22,62]。

3.3 胎兒弓形蟲病的診斷方法血清學(xué)、分子生物學(xué)、病理組織學(xué)和動物生物學(xué)分析等方法廣泛應(yīng)用于評價(jià)弓形蟲在綿羊流產(chǎn)中的作用，研究發(fā)現(xiàn)血清學(xué)方法的檢出率高于病理組織學(xué)或PCR方法[18]。但也有一些例外，如感染弓形蟲的小鼠血清呈陰性[63-64]，從血清陰性的自然感染小鼠[65]、大鼠[25]和豬[65]中分離出活的弓形蟲蟲株。因此，沒有弓形蟲抗體也不能排除沒有感染弓形蟲的可能。PCR方法在檢測綿羊弓形蟲垂直傳播中具有較高的敏感性和特異性，能克服胎兒自溶和免疫狀態(tài)的影響[22,24]。病理組織學(xué)診斷方法可鑒別病理損傷是否由弓形蟲感染所引起[66]。小鼠或貓的生物學(xué)分析方法能分析較大體積的組織(50或500 g)，可鑒別出胎盤或流產(chǎn)胎兒體內(nèi)是否含有弓形蟲活蟲株。臨床診斷需聯(lián)合幾種方法，客觀分析診斷結(jié)果。

4 展望

綿羊感染弓形蟲后，一般可獲得終生免疫。臨床上綿羊因弓形蟲垂直傳播而引起流產(chǎn)的危害較大，探索妊娠期綿羊弓形蟲病來源于外源性卵囊傳播，還是內(nèi)源性包囊重新激活的機(jī)制和發(fā)生的比例，可以指導(dǎo)臨床生產(chǎn)如何選育后備母羊，此外，也可為評估孕婦弓形蟲病風(fēng)險(xiǎn)因素提供參考依據(jù)。