丁酸鈉對(duì)IPI-2I細(xì)胞中pIgR表達(dá)的影響

鞏宇紅，金鑫鑫，袁勃雨，王 瑋

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

腸道黏膜層是機(jī)體最大的黏膜層，常與大量食物來源的微生物或抗原等異物接觸[1]。腸道也是機(jī)體最大的免疫器官，故而腸道黏膜免疫在機(jī)體的先天性和獲得性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。分泌型免疫球蛋白A (sIgA) 是腸道獲得性免疫的重要標(biāo)志物。sIgA是人類和其他哺乳動(dòng)物黏膜表面最重要的免疫球蛋白(Ig)亞型[2-3]。腸道固有層漿細(xì)胞產(chǎn)生的IgA和J鏈形成的二聚體，經(jīng)黏膜表面上皮細(xì)胞多聚免疫球蛋白受體(pIgR)轉(zhuǎn)運(yùn)后形成sIgA[4]。sIgA通過不同的分子機(jī)制維持腸道共生菌的生存并阻抑有害病原菌的侵入[5-6]。pIgR通過轉(zhuǎn)胞吞作用將分泌型免疫球蛋白的多聚體轉(zhuǎn)運(yùn)到腸道上皮細(xì)胞外的黏膜中以參與免疫反應(yīng)。pIgR是腸道黏膜中起免疫作用的重要功能蛋白[7]，能夠介導(dǎo)多聚免疫球蛋白(pIgs)穿越上皮細(xì)胞進(jìn)入腸腔內(nèi)發(fā)揮免疫功能。pIgR結(jié)合 pIgs，將其從黏膜上皮運(yùn)輸?shù)缴掀ぜ?xì)胞的頂端表面并分泌到管腔中，發(fā)揮免疫作用。同時(shí)pIgR中的分泌成分(SC)能夠幫助sIgA分子避免被水解[8]。pIgR不僅僅作為免疫球蛋白的受體發(fā)揮作用，它還能直接產(chǎn)生免疫效應(yīng)[9-10]。pIgR在上皮細(xì)胞中一般以兩種形式存在：dIgA配位鍵和無dIgA配位鍵。在細(xì)胞外膜上這兩種形式能通過蛋白裂解來釋放sIgA或者自由分泌片[11]。其中的分泌成分是pIgR連接dIgA的胞外片段部分，不僅能夠保護(hù)sIgA免受蛋白降解，還可以通過終止病毒復(fù)制的方式在細(xì)胞內(nèi)中和某些病毒，直接殺滅病毒[12]。此外pIgR中的分泌成分通過與某些細(xì)菌成分結(jié)合，防止其對(duì)上皮細(xì)胞的入侵[13]。

丁酸是一種短鏈脂肪酸，也是機(jī)體微生物的主要發(fā)酵產(chǎn)物。近年來，針對(duì)丁酸的大量研究結(jié)果表明，丁酸在促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育，保護(hù)仔豬腸黏膜完整性，改善腸道黏膜免疫等均發(fā)揮重要作用[14-15]。徐菊美等[16]的研究表明，靜脈灌注丁酸鈉能顯著增加仔豬結(jié)腸中sIgA的濃度。唐明紅等[17]的研究結(jié)果也顯示飼料中丁酸鹽的添加能夠增加育肥豬血清中IgA的含量。這些均表明丁酸能夠改善腸道黏膜免疫。

本試驗(yàn)旨在闡明丁酸鈉對(duì)豬回腸上皮細(xì)胞(IPI-2I)中pIgR表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能增加IPI-2I細(xì)胞pIgR的轉(zhuǎn)錄水平，該作用是受GPR109A介導(dǎo)的。丁酸鈉和GPR109A有望為飼料添加劑中替抗藥物的發(fā)掘和研究靶點(diǎn)的確認(rèn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞IPI-2I細(xì)胞，豬回腸上皮細(xì)胞系，受贈(zèng)于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張改平院士實(shí)驗(yàn)室。

1.2 化學(xué)試劑丁酸鈉粉末購于阿拉丁試劑有限公司，用ddH2O溶解后在超凈臺(tái)中過濾除菌，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，試驗(yàn)前再稀釋到所需濃度。Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄體系、熒光定量PCR試劑盒等均購買于日本TaKaRa公司；BCA試劑盒購于Thermo公司；胎牛血清購于Hyclone公司； SDS凝膠試劑盒、脫脂奶粉、細(xì)胞裂解液、增強(qiáng)型ECL超敏發(fā)光液、Tween-20等均購于碧云天生物技術(shù)公司；D-MEM培養(yǎng)基和青-鏈霉素購自GIBCO公司；兔抗β-Tubulin、ERK1/2、JNK和Akt抗體購自CST公司。

1.3 IPI-2I細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代將IPI-2I細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速解凍后接種于完全D-MEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)，用預(yù)熱好的0.25%胰酶消化30～60 s，離心后將細(xì)胞沉淀吹懸于完全D-MEM，吸取適量懸液接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 IPI-2I細(xì)胞的RNA提取培養(yǎng)皿中加入800 μL Trizol，靜置數(shù)分鐘，使細(xì)胞充分裂解脫落，然后移入無RNA酶的EP管，加入200 μL冷氯仿，上下顛倒20次充分混勻，靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。離心后吸取0.5 mL左右上層無色透明液體移入新的EP管，等比加入冷異丙醇，上下顛倒20次，4℃環(huán)境下靜置15 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，得白色RNA沉淀。棄上清，加入1 mL 75%的酒精， 4℃ 12 000 r/min離心5 min，該步驟重復(fù)兩次以清除殘留異丙醇。離心后用移液槍吸走殘留在管底的酒精，將離心管置于冰上在通風(fēng)處晾干，直至管底白色沉淀變?yōu)闊o色透明狀。加入20 μL冷的DEPC水，手指輕彈振蕩至沉淀溶解，于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.5 IPI-2I細(xì)胞中pIgR mRNA和GPR109A mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 (qPCR) 用于檢測(cè)GPR109A mRNA和pIgR mRNA在不同濃度丁酸鈉處理IPI-2I細(xì)胞24 h后的表達(dá)水平變化。提取細(xì)胞總RNA然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光染料、上下游引物和cDNA組成20 μL的體系，振蕩混勻并離心后進(jìn)行qPCR。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。引物序列如表1。在加樣過程中注意不要產(chǎn)生氣泡，減少試驗(yàn)誤差。

表1 引物序列與擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6 IPI-2I細(xì)胞中信號(hào)通路相關(guān)分子的檢測(cè)2 mmol/L丁酸鈉處理IPI-2I細(xì)胞，處理時(shí)間分別為0，5，15，30，60 min。將處理過的細(xì)胞用細(xì)胞刮刀刮下來，置于EP管內(nèi)，離心得細(xì)胞沉淀。使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用酶標(biāo)儀在570 nm的條件下測(cè)吸光值。將蛋白分裝，并通過免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AKT、ERK1/2和JNK信號(hào)通路激活情況。

1.7 ERK、AKT和JNK通路阻斷后對(duì)pIgR mRNA表達(dá)的影響選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到70% 左右時(shí)，分別使用10 μmol/L 的AKT抑制劑(MK2206)、ERK1/2抑制劑(U0126)及JNK抑制劑(SP600125)預(yù)處理2 h，丁酸鈉作用24 h后檢測(cè)細(xì)胞中pIgR的表達(dá)水平。共分5個(gè)試驗(yàn)組：NT組、丁酸鈉組、MK2206+丁酸鈉組、U0126+丁酸鈉組和SP600125+丁酸鈉組。提取5個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR檢測(cè)pIgR的表達(dá)水平。

1.8 阻斷GPR109A對(duì)PIGR mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，待密度達(dá)到60%左右時(shí)，使用GPR109A-ShRNA(MOI 20)慢病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，再用2 mmol/L丁酸鈉刺激細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)GPR109A是否介導(dǎo)了丁酸鈉對(duì)IPI-2I細(xì)胞中pIgR表達(dá)的調(diào)控作用。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉能增強(qiáng)IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)水平分別用0.0,1.0,1.5,2.0 mmol/L的丁酸鈉處理IPI-2I細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞總RNA以觀察pIgR mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，2.0 mmol/L丁酸鈉能顯著增強(qiáng)IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)水平(圖1)，故本試驗(yàn)最終選用2.0 mmol/L作為丁酸鈉的工作濃度。

2.2 丁酸鈉激活GPR109A用不同濃度(0.0,1.0,1.5,2.0 mmol/L) 的丁酸鈉處理IPI-2I細(xì)胞24 h，觀察GPR109A的激活情況。相較于空白對(duì)照組，丁酸鈉可促進(jìn)IPI-2I細(xì)胞GPR109A的表達(dá)，且呈劑量依賴性。在2.0 mmol/L時(shí)，有顯著性差異(圖2)。

2.3 GPR109A介導(dǎo)丁酸鈉對(duì)IPI-2I細(xì)胞中pIgR表達(dá)的調(diào)控為了沉默GPR109A受體，使用GPR109A-ShRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染IPI-2I細(xì)胞24 h，添加2.0 mmol/L丁酸鈉繼續(xù)作用24 h。結(jié)果顯示，相較于丁酸鈉組，GPR109A-ShRNA 慢病毒的干擾能夠顯著降低GPR109A的表達(dá)，說明受體沉默成功(圖3)。與此同時(shí)，相對(duì)于丁酸鈉組，GPR109A-ShRNA 慢病毒干擾阻斷了丁酸鈉對(duì)pIgR表達(dá)的促進(jìn)作用(圖4);表明丁酸鈉增加pIgR mRNA表達(dá)的作用是由GPR109A介導(dǎo)的。

圖2 丁酸鈉(NaB)促進(jìn)IPI-2I細(xì)胞GPR109A的表達(dá)(n=3)

圖3 GPR109A-ShRNA 慢病毒顯著降低GPR109A的表達(dá) 注：(n=3；**,##.P<0.01,*與NC比，#與NaB比;NaB.丁酸鈉。下同

2.4 2% mmol/L丁酸鈉促進(jìn)ERK1/2和AKT通路的活化用2% mmol/L丁酸鈉處理IPI-2I細(xì)胞0,5,15,30,60 min后，提取細(xì)胞總蛋白，并利用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、AKT和JNK通路的活化情況。結(jié)果表明，丁酸鈉處理30 min后，AKT通路活化最強(qiáng)；丁酸鈉處理90 min后，ERK1/2通路活化最強(qiáng)。以上結(jié)果顯示丁酸鈉能夠增強(qiáng)AKT和ERK1/2通路的活化(圖5)。

圖4 丁酸鈉(NaB)通過GPR109A發(fā)揮對(duì)pIgR表達(dá)的促進(jìn)作用 ****,####.P<0.000 1。下同

2.5 丁酸鈉通過ERK1/2調(diào)控IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)用10 μmol/L 的MK2206、U0126 和SP600125預(yù)處理細(xì)胞2 h，它們分別是AKT、ERK1/2和JNK信號(hào)通路的特異性抑制劑。隨后再用丁酸鈉作用24 h，檢測(cè)IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)量。相對(duì)于對(duì)照組，丁酸鈉組IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)量顯著增加，而ERK1/2 抑制劑(U0126)的預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)該作用， AKT抑制劑(MK2206)和JNK抑制劑(SP600125)的預(yù)處理對(duì)丁酸鈉導(dǎo)致的pIgR表達(dá)增高無抑制作用(圖6);以上結(jié)果表明丁酸鈉通過ERK1/2的活化來增加pIgR的表達(dá)。

3 討論

pIgR在黏膜免疫系統(tǒng)中有著舉足輕重的地位。pIgR參與黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)和固有免疫[18]，在將IgA從固有層轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面的過程中也發(fā)揮著一定的作用[10]。pIgR直接參與sIgA的形成，其可被酶切從而釋放其胞外區(qū)，即分泌片(SC)。而SC能結(jié)合dIgA形成sIgA，使其更為穩(wěn)定的發(fā)揮作用，免受蛋白酶降解。已證實(shí)游離的SC和sIgA有助于以新的方式調(diào)節(jié)對(duì)病原體的天然的“非特異性”反應(yīng)，同時(shí)限制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[19]。

丁酸鹽除了作為細(xì)胞重要的能量來源外，還具有直接的免疫調(diào)節(jié)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn),在斷奶仔豬日糧中添加丁酸鈉可抑制肥大細(xì)胞的活化從而抑制TNF-α和IL-6的mRNA 表達(dá),其機(jī)制是抑制JNK信號(hào)通路的磷酸化水平[21]。而TIAN 等[22]研究結(jié)果表明,丁酸鈉通過顯著下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6 等促炎因子的mRNA 表達(dá),并上調(diào)IL-10 等抗炎細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá),從而緩解體內(nèi)炎癥反應(yīng)。XU等[23]用丁酸鈉溶液灌胃初生仔豬,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸鈉通過下調(diào)仔豬回腸中HDACs 的表達(dá),抑制IL-6、IL-8 和INF-γ 等促炎因子的mRNA 表達(dá)。在本試驗(yàn)中，我們重點(diǎn)觀察了丁酸鈉處理對(duì)豬回腸上皮細(xì)胞系中與黏膜免疫相關(guān)蛋白pIgR表達(dá)的影響。

圖5 丁酸鈉(NaB)能夠增強(qiáng)AKT和ERK1/2活化

圖6 丁酸鈉(NaB)通過ERK1/2調(diào)控IPI-2I細(xì)胞中pIgR的表達(dá)

GPR109A最早被證明介導(dǎo)了煙酸降低血脂的作用，但近期報(bào)道證實(shí)GPR109A與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)也息息相關(guān)。已有報(bào)道證實(shí)，丁酸作為腸道內(nèi)細(xì)菌消化纖維素的產(chǎn)物，在結(jié)腸中可經(jīng)由GPR109A抑制腸道內(nèi)炎癥，抑制腸道內(nèi)巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞的活化，并引起Treg細(xì)胞的分化和IL-10的產(chǎn)生，從而降低炎癥程度和減少結(jié)腸癌的發(fā)生[24]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，丁酸激活GPR109A能夠顯著降低斷奶應(yīng)激造成的仔豬腹瀉比率及嚴(yán)重程度，顯著降低結(jié)腸部位炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[14]；通過對(duì)人工化學(xué)誘導(dǎo)的GPR109A-/-鼠和WT鼠結(jié)腸炎模型的觀察，發(fā)現(xiàn)GPR109A-/-鼠具有更加嚴(yán)重的腸道炎癥和腸道通透性的提高；利用丁酸激活GPR109A，抑制了NF-κB以及AKT的磷酸化，可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的分泌，從而對(duì)緩解TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病(IBD)小鼠模型的腹瀉癥狀[25]。因此我們合理假設(shè)，丁酸鈉對(duì)pIgR表達(dá)的促進(jìn)作用也是由GPR109A介導(dǎo)的。我們使用GPR109A-ShRNA慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功干擾受體，發(fā)現(xiàn)GPR109A的缺失或沉默導(dǎo)致丁酸鈉對(duì)pIgR表達(dá)的增強(qiáng)作用受到了顯著抑制，證明丁酸鈉對(duì)pIgR mRNA表達(dá)的調(diào)控作用依賴于GPR109A。

研究表明，Gi型G蛋白偶聯(lián)受體的激活會(huì)導(dǎo)致ERK1/2 信號(hào)通路的激活[26]。我們之前的研究結(jié)果也表明，BHBA在激活GPR109A的同時(shí)也伴隨著ERK1/2通路的活化[27]。在本試驗(yàn)中，我們使用蛋白印跡試驗(yàn)檢測(cè)丁酸鈉對(duì)IPI-2I細(xì)胞中信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果表明，丁酸鈉處理顯著增強(qiáng)了IPI-2I細(xì)胞中ERK1/2和AKT通路的活化。為了進(jìn)一步研究丁酸鈉對(duì)pIgR表達(dá)影響過程中ERK1/2和AKT通路發(fā)揮的作用，我們使用特異性抑制劑阻斷通路，發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路的阻斷顯著減少丁酸鈉處理導(dǎo)致的pIgR mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。而阻斷JNK通路和AKT通路并不能對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)的pIgR mRNA表達(dá)的升高產(chǎn)生顯著影響。以上結(jié)果表明，ERK1/2通路在丁酸鈉誘導(dǎo)的pIgR表達(dá)增加中發(fā)揮著重要作用。