2018―2019年河南地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學調(diào)查

趙小月，張 格，汪 悅，劉紅英，陳 宇，趙 軍，王川慶，陳 陸，李永濤

(河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒( porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙及各階段豬呼吸道癥狀為特征的傳染病[1，2]。該病最早于1987年出現(xiàn)于美國，目前在全球大部分地區(qū)流行，至今仍為困擾世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。我國于1996年首次報道分離到PRRSV[3]，至今為止已歷經(jīng)20余年的流行及演變。2006年由PRRSV變異株引起的高致病性PRRS疫情在我國豬群大面積暴發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。2012年本實驗室首次發(fā)現(xiàn)并報道來源于美國的PRRSV類NADC30毒株(HENAN-HEB和HENAN-XINX)在我國豬群的流行[5]。此后，類NADC30毒株在我國北方相繼出現(xiàn)并蔓延至全國。該類毒株之間致病性差異較大，且易與其他毒株發(fā)生重組，商品化疫苗尚不能對豬群進行有效保護，已成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展最主要的PRRSV類型。此外，自2010年PRRSV類QYYZ毒株在廣東省出現(xiàn)以來，相繼蔓延至我國南方各省，此后在西北、西南、華東和華中等地區(qū)均有報道。PRRSV類QYYZ毒株與其他類型毒株之間能夠發(fā)生基因重組產(chǎn)生新的子代病毒，給養(yǎng)豬業(yè)疫病防控帶來新的挑戰(zhàn)。

目前，我國存在2種PRRSV類型，包括基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。SHI等[12]根據(jù)8 624條PRRSV的ORF5序列將基因Ⅱ型PRRSV分為9個Lineage，每個譜系之間的遺傳距離都大于11%，并將Lineage 1細分為9個Sublineage。ZHANG等[6]首次將Lineage 3進一步細分為5個Sublineage。我國豬群中目前流行Lineage 1，Lineage 3，Lineage 5，Lineage 8和Lineage 9等多種類型PRRSV毒株，其中 Lineage 1中的類NADC30毒株和Lineage 8中的類JXA1毒株是主要流行毒株[13]。河南地處中原、交通便利，作為我國重要的養(yǎng)豬大省和生豬調(diào)運大省，面臨著更為嚴峻的動物疫病輸入和傳播風險。本實驗室自2012年起持續(xù)監(jiān)測PRRSV流行情況并追蹤PRRSV流行和進化動態(tài)[14-15]。為了解2018―2019年河南地區(qū)PRRS流行現(xiàn)狀和演化規(guī)律，本研究通過對采自河南省18個地市的414份臨床樣品進行PRRSV RT-PCR檢測，并對陽性樣品進行ORF5與NSP2基因擴增、測序和遺傳進化分析，從而發(fā)現(xiàn)PRRSV最新的流行動態(tài)和遺傳變異情況，為PRRS防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理2018年1月至2019年10月采自河南省18個地區(qū)94個豬場的414份豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)樣品，凍存于-80℃。

1.2 引物設計參照周峰等[15]根據(jù)GenBank中PRRSV CH-1a株(AF132118)、NADC30株(JN654459)和JXA1株(EF112445)設計針對ORF5和NSP2基因的2對特異性引物，并交河南尚亞生物科技公司合成。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA取采集病料組織樣品，用PBS按照1∶5比例進行稀釋后，充分研磨，將組織勻漿反復凍融3次，8 000 r/min離心8 min，取上清。參照Trizol reagent說明書提取RNA，將提取的RNA凍存于-80℃。

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，主要步驟為配置模板與引物預混物，70℃水浴10 min，4℃冰浴3 min 后，與反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (200 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、dNTP(10 mol/mL)混合，42℃， 1 h；70℃，15 min反應后4℃冷卻，得到cDNA保存于-20℃用于PCR檢測。

1.4 基因序列的擴增將陽性樣品的ORF5基因與NSP2基因的擴增產(chǎn)物通過膠回收純化后克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，擴大培養(yǎng)的菌液經(jīng)PCR鑒定，挑選陽性克隆送河南尚亞生物科技公司測序。

1.5 PRRSV ORF5與NSP2基因的同源性分析與氨基酸比對將獲得的ORF5與NSP2基因及其推導的氨基酸序列進行整理，通過DNAStar中的MegAlign與GenBank上公布的參考毒株序列進行同源性分析和氨基酸的遺傳變異分析。

1.6 PRRSV的遺傳進化分析將獲得基因序列利用MegAlign進行序列比對，利用MEGA 6.0對獲得的毒株序列與參考毒株序列進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 河南地區(qū)PRRSV的檢測結(jié)果對2018―2019年采自河南各地區(qū)的414份疑似PRRS的臨床樣品進行RT-PCR檢測，共檢測出PRRSV陽性樣品106份，陽性率為25.48%。按地域劃分，全省各地區(qū)豬群均存在PRRSV感染，尤其以焦作、鶴壁、安陽和新鄉(xiāng)等豫北地區(qū)豬群陽性檢出率較高，其中焦作陽性率最高(表1)。此外，根據(jù)采樣時間統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，第四季度相對于其他季度陽性率較高，檢出率為31.46%，其中2018年11月份PRRSV的檢出率最高(37.04%)，在季節(jié)交替的月份PRRSV陽性率也明顯增高。

表1 河南各地市PRRSV陽性檢出率

2.2 PRRSV ORF5和NSP2基因克隆、測序及遺傳進化分析通過T-A克隆、篩選陽性質(zhì)粒以及測序共獲得83個PRRSV ORF5和31個NSP2基因序列。經(jīng)遺傳進化分析顯示，31株PRRSV的 NSP2基因遺傳進化分析分別和與之對應的ORF5基因遺傳進化分析結(jié)果保持一致，均處于同一譜系(圖1B，本研究毒株用紅線表示)。2018―2019年在河南地區(qū)共檢出4種類型，包括Lineage 1，Lineage 3，Lineage 5以及Lineage 8。其中74株PRRSV與NADC30處于同一進化分支，屬于Lineage 1；6株PRRSV與QYYZ毒株處于同一進化分支，屬于Lineage 3；2株PRRSV為類JXA1毒株，屬于Lineage 8；僅檢測到1株PRRSV 經(jīng)典毒株屬于Lineage 5(圖1A)。

2.3 Lineage 1 的遺傳進化分析本試驗將已獲得的74株Lineage 1 PRRSV與GenBank上69 株Lineage 1參考毒株的ORF5序列進行遺傳演化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究檢測到的74株PRRSV均為類NADC30毒株，且類NADC30毒株屬于Sublineage 1.8(圖2，Sublineage 1.8用紅色表示)，與上述研究結(jié)果一致。

2.4 Lineage 3的遺傳進化分析本研究將檢測到的6株類QYYZ毒株(用●標出)同GenBank 上34株Lineage 3 PRRSV(包含本實驗室檢測的河南地區(qū)5株用■標出) 的ORF5序列進行遺傳進化分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)檢測到的6株類QYYZ毒株均為Sublineage 3.5，其中3株(HENAY-8、HENLY-11、HENLY-12)與河南地區(qū)流行毒株HENJY-1親緣關系較近，而另外3株(HENXX-22、HENXX-29、HENXX-30)則與江西流行毒株JX1411的親緣關系較近。通過遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，本實驗室2014-2016年檢測到的5株PRRSV均為類QYYZ毒株，其中1株 HENNY-3屬于Sublineage 3.2，也進一步說明河南地區(qū)早在2014之前便存在了Lineage 3的流行，且不僅是單一的Sublineage 3.5的流行。

圖1 基于部分ORF5基因(A)與NSP2基因(B)構(gòu)建PRRSV的遺傳進化分析

圖2 74株Lineage 1 PRRSV遺傳演化分析

2.5 PRRSV ORF5基因核苷酸和氨基酸序列分析ORF5基因核苷酸及推導的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，74株類NADC30毒株之間ORF5核苷酸序列相似性為86.1%～100.0%,氨基酸相似性為85.5%～100.0%；與美國NADC30毒株的氨基酸相似性為90.5%～96.5%，表現(xiàn)出較大的差異性。6株類QYYZ毒株之間核苷酸相似性為88.1%～99.5%，氨基酸相似性89.6.1%～100%，同QYYZ毒株氨基酸相似性為91.0%～94.5%。另有HENSQ-3和HENXC-13毒株序列與JXA1株的同源性較高，分別為99.2%和99.0%；1株(HENZZ-16)與經(jīng)典疫苗毒株RespPRRS MLV的同源性為100.0%。

圖3 Lineage 3 PRRSV遺傳進化分析

83株PRSSV毒株GP5蛋白均存在氨基酸替換與突變。其中，74株類NADC30 毒株的變化較大，存在有不同程度的氨基酸的缺失與插入，4株在GP5蛋白第33位缺失1個氨基酸(以VR2332為參考)，位于GP5蛋白的高變區(qū)HVR1(aa32-35)，表現(xiàn)出相同特征性的核苷酸缺失模式；6株PRRSV在GP5蛋白上第57位插入1個賴氨酸(Lsy)，該插入位點在GP5蛋白的高變區(qū)HVR2，部分代表毒株的氨基酸位點分析如圖4(方框表示插入與缺失氨基酸位點)；在GP5蛋白的第13位和第151位毒力相關氨基酸處，有45株類NADC30毒株與NADC30保持一致(Q13和K151)，其余毒株的第13位和第151位毒力氨基酸均發(fā)生變化，其中HENXX-13與JXA1株毒力氨基酸相同(R13和R151)。

圖4 10株缺失(插入)類NADC30毒株ORF5推導的氨基酸比對

2.6 PRRSV NSP2基因核苷酸及其推導的氨基酸序列分析31株PRRSV NSP2基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列變異分析顯示，與VR2332和CH-1a株相比，出現(xiàn)多處氨基酸位點缺失和突變，其中29株PRRSV與NADC30毒株NSP2蛋白高度同源，與NADC30毒株存在相同缺失特征，即在322aa-432aa、483aa、504aa-522aa位缺失131個氨基酸；2株毒株(HENXX-12和HENXX-28株)在不連續(xù)的131氨基酸缺失基礎上，在501aa-502aa新增加2個氨基酸缺失。此外，HENSQ-3毒株與JXA1毒株 NSP2蛋白高度同源，其在481aa位及533aa-561aa共有30個氨基酸的缺失；HENZZ-16與RespPRRSV MLV 毒株NSP2蛋白基本一致，氨基酸相似性高達99%(圖5)。

圖5 31株 PRRSV NSP2推導的氨基酸比對

3 討論

目前，PRRS依然是嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大傳染病之一，該病能引起母豬的繁殖障礙和仔豬呼吸困難，并在國內(nèi)豬群廣泛流行[2]。本研究對河南地區(qū)414份PRRSV 疑似樣品進行RT-PCR 檢測，共檢出PRRSV陽性樣品106份，陽性率達25.48%。與本實驗室2012―2017年對河南地區(qū)PRRSV檢測情況相比，整體上趨于穩(wěn)定，但不同地市和不同月份陽性率差異較大。PRRSV對豬群的感染受季節(jié)變化的影響，在秋冬季節(jié)PRRSV的檢出率較高，在季節(jié)交替的月份PRRSV陽性率也明顯增多。

PRRSV基因變異分布于整個基因組，由于GP5為PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白，其具有病毒免疫保護相關的中和抗原表位和誘騙抗原表位[16]，ORF5與NSP2是病毒基因組中變化最大的基因，因而通常將ORF5和NSP2作為病毒遺傳變異與進化分析的靶基因。本研究測定的83株PRRSV的ORF5序列屬于4種類型，即Sublineage 1.8(NADC30-Like)，Sublineage 3.5(QYYZ-Like)，Sublineage 8.7(HP-PRRSV-Like)和Sublineage 5.1(RespPRRS MLV-like)。74株PRRSV均屬于NADC30-like(Sublineage 1.8)，占所測毒株的89.15%，說明類NADC30毒株仍是河南地區(qū)最主要的流行毒株，但是74 株類NADC30毒株之間的核苷酸和氨基酸的同源性差異較大，提示河南地區(qū)類NADC30毒株不斷進化、更加復雜。此外，6株類QYYZ(Sublineage 3.5)毒株分別與HENJY-1和JX1411的親緣關系較近，說明河南類QYYZ毒株很有可能由外省流行毒株傳入河南并在省內(nèi)各地區(qū)傳播，加劇了省內(nèi)PRRSV流行毒株的復雜性和多樣性。通過Lineage3 遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，本實驗室2014―2016年檢測到的6株PRRSV亦屬類QYYZ毒株，其中1株 HENNY-3屬于Sublineage 3.2，也進一步說明河南地區(qū)早在2014之前便存在Lineage 3毒株，且不僅是單一的Sublineage 3.5的流行。

近幾年Lineage 3 PRRSV在華南地區(qū)廣泛流行，傳播迅速，使其在PRRSV中的比例顯著增加。研究表明中國流行的Sublineage 3.5 PRRSV是由中國臺灣地區(qū)的Sublineage 3.2傳至福建，由福建傳至廣東[6]。自2010年以來，中國至少有12個省份被檢測到有Lineage 3的流行，親緣關系分析顯示絕大多數(shù)省份流行的Lineage 3毒株由廣東傳入。與類NADC30毒株相似，Lineage 3在田間與PRRSV的2個不同譜系之間存在頻繁的重組。LONG等[18]報道的 PRRSV SCcd16毒株，是Lineage 3 PRRSV與Lineage 1和Lineage 8 PRRSV 同時發(fā)生的重組；此外，在福建省發(fā)現(xiàn)的1株PRRSV毒株(FJLIUY-2017)，該毒株是在Lineage 1、Lineage 3、Lineage 5和Lineage 8之間存在的復雜的基因組重組PRRSV[19]。

NSP2蛋白是PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復制過程中起著關鍵作用，其蛋白的高變區(qū)可耐受一定數(shù)量氨基酸的突變、插入或缺失。類NADC30毒株的NSP2蛋白的131個氨基酸不連續(xù)缺失，HP-PRRSV毒株NSP2蛋白存在30個氨基酸不連續(xù)缺失，類QYYZ毒株的NSP2區(qū)具有36個氨基酸的連續(xù)插入。本研究獲得的31株PRRSV NSP2基因中，29株PRRSV與NADC30毒株存在相同缺失特征，HENXX-12和HENXX-28在不連續(xù)的131氨基酸缺失基礎上，在501aa-502aa新增加了2個氨基酸缺失，將存在該種特殊缺失毒株的NSP2蛋白序列與GenBank中已收入的序列進行比對發(fā)現(xiàn)是一種新的缺失突變模式。此外，GP5是PRRSV變異最為明顯的結(jié)構(gòu)蛋白，包括N端信號肽區(qū)域、誘騙表位(Decoy)、中和表位(PNE)、2個高變區(qū)(HVRs)和3個跨膜區(qū)(zf7576)[22-23]。抗原位點位于GP5的N端，蛋白內(nèi)的誘騙表位和數(shù)量不等的糖基化使重要的中和抗原位點變得不明顯，從而阻礙了中和抗體的產(chǎn)生進而利于PRRSV的體內(nèi)增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)不同毒株GP5蛋白的氨基酸序列存在著顯著差異，類NADC30毒株HENLY-8、HENLY-9、HENLY-10和HENZMD-12株第33位氨基酸的缺失發(fā)生在N端信號肽的B細胞表位(AR27-35)和鄰近糖基化位點，可能對抗原表位存在空間阻位效應。此外，HENLY-11、HENLY-12、HENAY-8、HENXX-22、JENXX-29和HENXX-30毒株GP5蛋白第57位出現(xiàn)1個新的插入位點(Lys57)，這種在GP5蛋白高變區(qū)出現(xiàn)的插入或缺失類型先前未有報道，該插入位點對病毒復制和致病性有何影響需進一步研究。

NADC30-like毒株傳入我國時間雖然較短，但因其具有較強的基因變異和重組能力，迅速成為我國豬群中優(yōu)勢流行毒株。當前的商品化疫苗對類NADC30病毒的保護效果不理想，使豬場PRRS臨床防控難度加大。本研究從74株NADC30-like毒株中隨機選取2株進行全基因的擴增與重組分析發(fā)現(xiàn)，2株PRRSV毒株均為NADC30和JXA1-P100的重組毒株，說明了類NADC30毒株與HP-PRRSV 疫苗株之間重組的普遍性，那么商品化疫苗在豬場的使用可能會加劇類NADC30毒株在田間毒株類型的復雜性，值得我們警惕和監(jiān)測?？偠灾怤ADC30毒株已經(jīng)成為河南地區(qū)最主要的流行毒株，HP-PRRSV毒株在逐漸減少，類QYYZ毒株的流行增加了PRRSV流行的復雜性。目前河南地區(qū)PRRSV遺傳進化與流行都存在復雜性，主要體現(xiàn)在PRRSV毒株類型多樣性、氨基酸變異普遍性、類NADC30毒株之間的較大差異性、類NADC30毒株重組高頻性以及弱毒疫苗對強毒株的干擾性。合理使用商品化疫苗，做好毒株流通監(jiān)測加大對類NADC30毒株的監(jiān)測與防控尤為重要。