盲腸結(jié)扎穿刺和脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性呼吸窘迫綜合征模型的建立和分析

朱艷 齊倩 孟麗 周晨明 徐海博

1河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心,石家莊050017;2河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室,石家莊050017;3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科,石家莊050000

ARDS是一種臨床表現(xiàn)為急性低氧血癥和進(jìn)行性加重的呼吸困難的臨床綜合征。盡管在ARDS發(fā)病機(jī)制方面的研究取得了很大進(jìn)展,但病死率仍高達(dá)30%～40%[1]。因此,建立理想可靠的動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制、病理改變等有著重要的意義。臨床中ARDS的發(fā)生、發(fā)展通常由多種致病因素聯(lián)合導(dǎo)致,目前研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制除原發(fā)病因造成肺損傷外,還存在手術(shù)創(chuàng)傷、腸道細(xì)菌毒素入血等 “二次打擊”因素[2-4]。目前ARDS動(dòng)物模型包括氣管、腹腔或尾靜脈注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、油酸,盲腸結(jié)扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)等[5]。氣管、腹腔或尾靜脈注射LPS由于操作簡便而被廣泛應(yīng)用,但單純的LPS所致的損傷難以模擬人類ARDS,且不能持久。CLP能較好地模擬膿毒癥導(dǎo)致出現(xiàn)肺部急性期損傷表現(xiàn)而用于相關(guān)研究[6]。本研究通過檢測炎性指標(biāo)以及對(duì)肺組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查,分析和比較CLP、LPS單因素誘導(dǎo)與CLP和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)形成 “二次打擊”建立的ARDS模型的異同,探索建立穩(wěn)定可靠、更能模擬人類ARDS的發(fā)病過程的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠176只,體質(zhì)量210～230 g,由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 試劑與儀器 主要試劑:大腸桿菌LPS血清型 O111:B4(Sigma-Aldrich,美 國),IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒 (Thermo Fisher,美國)。主要儀器:體積描記器 (EMMS,英國),低溫離心機(jī) (Thermo,美國),全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 (Sysmex,日本),透射電子顯微鏡(日立H-7500,日本)。

1.3 方法

1.3.1 ALI/ARDS模型制備 176只SD大鼠隨機(jī)分為CLP組、LPS組、CLP+LPS組和對(duì)照組,每組44只。CLP組行CLP,大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水,10%水合氯醛按1 mg/kg腹腔注射將其麻醉,仰位固定,備皮消毒。于大鼠腹正中處切開1 cm切口,進(jìn)腹找到盲腸,1號(hào)絲線結(jié)扎1/2盲腸,以20G針頭在游離端對(duì)穿2次 (4個(gè)孔)后送回腹腔,縫合切口。置籠內(nèi)自由活動(dòng),不禁飲食。LPS組尾靜脈注射LPS(2 mg/kg)。CLP+LPS組行CLP 30 min后,尾靜脈注射LPS(2 mg/kg)。對(duì)照組開腹暴露盲腸后縫合,尾靜脈注射生理鹽水2 ml/kg。每組分為4個(gè)亞組,每組11只,用于在損傷誘導(dǎo)后4、12、24、48 h檢測各項(xiàng)呼吸功能、炎性指標(biāo)和病理組織學(xué)觀察。

1.3.2 評(píng)估呼吸功能 觀察大鼠的紫紺、呼吸窘迫情況。在每個(gè)時(shí)間間隔,每個(gè)亞組存活的大鼠中隨機(jī)選6只置于體積描記器中,以測量呼吸頻率和潮氣量。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎性指標(biāo)檢測 大鼠處死后,結(jié)扎右側(cè)肺門,用4℃生理鹽水對(duì)左側(cè)支氣管肺泡進(jìn)行灌洗,每次2.5 ml,緩慢重復(fù)3次,將收集的BALF離心 (4℃,離心半徑30 cm,1 000 r/min,10 min),取上清,按照試劑盒說明書操作,測定BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。將BALF離心后的細(xì)胞重懸計(jì)數(shù),用血細(xì)胞分析儀測定白細(xì)胞計(jì)數(shù)、多形核白細(xì)胞百分比,用BCA試劑盒測定總蛋白含量。

1.3.4 肺組織濕干重比 處死剩余存活大鼠,切除左肺并立即稱重,然后在90℃的培養(yǎng)箱中干燥24 h后重新稱重,計(jì)算濕干重比。

1.3.5 肺組織病理變化 取右肺組織4%多聚甲醛固定,脫水、石蠟包埋,切片后HE染色,鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3.6 透射電鏡觀察 取右肺組織 (1 mm×1 mm×3 mm)4%戊二醛固定后,進(jìn)行常規(guī)透射電鏡樣品制備:1%四氧化鋨固定,丙醇逐級(jí)脫水,梯度滲透,環(huán)氧樹脂812包埋。用萊卡UC7超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,在日立H-7500型透射電鏡下觀察,加速電壓為80 kV。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示,計(jì)數(shù)資料以百分率表示。運(yùn)用單因素方差分析 (One-way ANOVA),然后用Bonferroni法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡率及表征的比較 CLP組大鼠在術(shù)后12 h出現(xiàn)呼吸急促,伴有明顯的呼吸窘迫和紫紺,并在24 h出現(xiàn)死亡率峰值 (27.3%)。在LPS組中,刺激后4 h呼吸顯著加快,伴有呼吸窘迫和紫紺,在12 h出現(xiàn)最大死亡率 (18.2%),在24 h死亡率降到9.1%。CLP+LPS組中,4 h左右大鼠開始出現(xiàn)呼吸窘迫癥狀,24 h達(dá)到高峰,48 h刺激后仍然明顯。對(duì)照組大鼠未見呼吸窘迫、紫紺或死亡。見表1。

2.2 各組大鼠呼吸頻率比較 各組大鼠呼吸頻率見表2。

表2 各組大鼠呼吸頻率比較 (±s,n=6)

表2 各組大鼠呼吸頻率比較 (±s,n=6)

注:CLP為盲腸結(jié)扎穿刺;LPS為脂多糖;與對(duì)照組比較,a P＜0.05;與LPS組比較,b P＜0.05;與CLP+LPS組比較,c P＜0.05

組別 呼吸頻率 (次/min)4 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 73±12 70±8 69±4 65±6 CLP組 90±7 abc 119±16 ac 142±19 ab 93±11 a LPS組 117±10 a 139±17 a 89±11 c 70±8 c CLP+LPS組 127±9a 158±22 a 161±26 a 113±15a

2.3 各組大鼠肺水腫指標(biāo)比較 各組大鼠BALF中總蛋白含量和肺組織濕干重比見表3、4。

表3 各組大鼠BALF中總蛋白含量的比較 (±s,n=6)

表3 各組大鼠BALF中總蛋白含量的比較 (±s,n=6)

注:BALF為支氣管肺泡灌洗液;CLP為盲腸結(jié)扎穿刺;LPS為脂多糖;與對(duì)照組比較,a P＜0.05;與CLP+LPS組比較,b P＜0.05

組別 總蛋白 (g/L)4 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 2.71±0.82 2.83±0.51 2.97±0.76 2.37±0.91 CLP組 2.96±0.88 b 3.37±0.74 4.65±1.03 a 2.84±0.81 LPS組 4.14±0.78 a 4.69±1.01 a 3.12±0.94 b 2.95±1.02 CLP+LPS組 4.81±0.97a 5.28±0.74a 6.24±1.91a 3.12±0.88

2.4 各組大鼠BALF中肺損傷相關(guān)指標(biāo)比較 見表5。

2.5 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 CLP+LPS組4 h可觀察到肺泡間隔增寬,肺間質(zhì)水腫,肺泡腔內(nèi)有液體滲出,12、24 h均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡腔有大量滲出液,肺間質(zhì)明顯充血水腫,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,48 h病理損傷減輕。CLP組大鼠4 h肺組織基本未變化,12 h出現(xiàn)輕度損傷,24 h損傷最重。LPS組大鼠4 h肺組織出現(xiàn)病理損傷,12 h損傷最重,24 h好轉(zhuǎn)。對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,無損傷表現(xiàn)。24 h各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)見圖1。

2.6 肺組織電鏡觀察 CLP+LPS組12、24 h肺損傷嚴(yán)重,可觀察到Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷,胞質(zhì)、核質(zhì)水腫,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒,線粒體腫脹,線粒體嵴和膜融合不清。CLP組24 h、LPS組12 h損傷最重,但肺損傷比CLP+LPS組24 h輕,可觀察到線粒體輕度腫脹,核周間隙輕度增寬。24 h各組大鼠電鏡觀察見圖2。

表4 各組大鼠肺組織濕干重比的比較 (±s)

表4 各組大鼠肺組織濕干重比的比較 (±s)

注:CLP為盲腸結(jié)扎穿刺;LPS為脂多糖

組別肺濕干重比4 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 3.31±0.88（n=5） 3.65±1.25（n=5） 3.50±0.97（n=5） 3.87±0.48（n=5）CLP組 3.96±0.71（n=4） 4.39±0.69（n=4） 5.28（n=2） 4.03±0.73（n=4）LPS組 4.22±0.64（n=4） 4.35±0.69（n=3） 3.81±0.68（n=4） 3.99±0.69（n=5）CLP+LPS組 4.15±0.59（n=4） 4.86±0.55（n=3） 5.27（n=2） 4.19±1.1（n=3）

表5 各組大鼠肺損傷相關(guān)指標(biāo)比較 (±s,n=6)

表5 各組大鼠肺損傷相關(guān)指標(biāo)比較 (±s,n=6)

注:CLP為盲腸結(jié)扎穿刺;LPS為脂多糖;與對(duì)照組比較,a P＜0.05;與LPS組比較,b P＜0.05;與CLP+LPS組比較,c P＜0.05

組別 多形核白細(xì)胞百分比 (%)白細(xì)胞 (×104/μl)4 h 12 h 24 h 48 h 4 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 39.43±11.37 40.21±10.08 43.25±12.39 35.51±15.77 1.11±0.03 0.92±0.08 0.81±0.05 0.72±0.06 CLP組 42.35±6.09 48.67±8.09c 63.17±6.49a 36.17±9.28 1.53±0.92bc 6.35±1.07a 8.57±3.42ab 1.68±0.76 LPS組 57.17±5.98a 64.19±7.15a 47.77±6.78c 35.15±9.18 5.87±4.56a 7.19±2.41a 2.18±0.93c 1.03±0.56 CLP+LPS組 59.45±7.09a 82.57±6.07a 84.02±7.15a 43.77±3.87 6.45±3.91a 8.79±2.11a 11.44±8.21a 2.31±1.14組別 腫瘤壞死因子α（ng/L）4 h 12 h 24 h 48 h IL-6（ng/L）4 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 93.28±4.15 83.79±3.51 84.22±3.28 85.32±3.64 5.49±1.76 5.41±1.07 4.46±0.87 4.35±0.93 CLP組 102.98±47.56c 256.45±50.32a 327.53±74.26ab 112.35±43.63 6.77±5.59bc 15.83±8.24abc 39.76±9.17ab 21.49±7.46ab LPS組 187.49±40.34a 272.34±54.59a 115.32±31.50ac 93.45±20.49 18.57±7.65a 28.36±7.49a 11.61±8.51ac 6.52±6.89c CLP+LPS組 209.76±56.89a 312.87±54.69a 447.23±99.38a 108.34±39.32 21.96±9.62a 32.79±9.16a 47.87±8.76a 28.79±5.97a

3 討論

建立理想的ARDS動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制及防治有重要意義。理想的動(dòng)物模型應(yīng)該復(fù)制人類肺損傷的發(fā)生機(jī)制和病理生理改變。據(jù)報(bào)道,70%的臨床ARDS病例與膿毒癥相關(guān)[7]。CLP可模擬臨床感染引發(fā)膿毒血癥從而導(dǎo)致肺部損傷的致病過程,被用于建立ARDS動(dòng)物模型。但有研究表明CLP不單獨(dú)引發(fā)肺損傷,而是通過聯(lián)合其他刺激造成 “二次打擊”來促使肺損傷的發(fā)生[8]。LPS是內(nèi)毒素的主要成分,進(jìn)入機(jī)體后激活巨噬細(xì)胞釋放促炎因子,肺作為最敏感的器官之一最先受到損傷,肺血管通透性增加,組織液滲出,促使ARDS的形成[9-10]。但單純的LPS所致的損傷難以模擬人類復(fù)雜的ARDS病理生理過程,且不能持久[11]。本研究嘗試在大鼠中實(shí)施CLP和尾靜脈注射LPS聯(lián)合誘導(dǎo),形成 “二次打擊”來建立穩(wěn)定的肺損傷模型。其理論基礎(chǔ)是:第1次刺激 (嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染等)引起機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合征,機(jī)體敏感性增高,此基礎(chǔ)上第2次刺激 (細(xì)菌感染等)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征失控,體內(nèi)炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡,機(jī)體發(fā)生ARDS,甚至多器官功能障礙綜合征。在前期實(shí)驗(yàn)中,以常規(guī)動(dòng)物模型劑量的LPS(5 mg/kg)與CLP聯(lián)合誘導(dǎo)損傷后4 h內(nèi)是致死的。因此,筆者嘗試降低LPS的劑量,使用2 mg/kg的LPS和CLP相結(jié)合。在該模型中,大鼠出現(xiàn)了與ARDS發(fā)展相關(guān)的臨床、生物化學(xué)和組織病理學(xué)變化。其中炎癥反應(yīng)與呼吸窘迫的關(guān)系十分密切[12]。機(jī)體受到損傷刺激后,釋放大量的炎性因子 (如TNF-α、IL-6等)[13],炎性因子可激活巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,血管通透性升高,出現(xiàn)肺水腫[14]。而BALF中的蛋白含量及肺濕干重比則是反映肺水腫程度的指標(biāo)。本研究中,與CLP組、LPS組和對(duì)照組相比,CLP+LPS組12 h和24 h的呼吸頻率、TNF-α、白細(xì)胞、多形核白細(xì)胞百分比、IL-6水平顯著升高。CLP組呼吸窘迫癥狀、炎癥指標(biāo)、肺水腫指標(biāo)和肺病理損傷在12 h出現(xiàn)升高,在24 h達(dá)到峰值,48 h降低。LPS組上述指標(biāo)在4 h即出現(xiàn)升高,12 h達(dá)到高峰,24 h下降,大鼠呼吸窘迫癥狀好轉(zhuǎn),48 h呼吸窘迫基本消失。CLP組大鼠呼吸窘迫出現(xiàn)時(shí)間晚但持續(xù)時(shí)間長,LPS組出現(xiàn)時(shí)間早但恢復(fù)快,聯(lián)合誘導(dǎo)組結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn),產(chǎn)生持續(xù)至少24 h的呼吸窘迫,肺損傷比單種刺激模型更嚴(yán)重,并且24 h死亡率接近臨床ARDS的死亡率 (30%～40%)[1]。因此,在建立模型時(shí)還應(yīng)考慮此因素,至少要3～4只以上的大鼠。綜上所述,筆者建議行CLP,然后尾靜脈注射LPS誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)呼吸窘迫,在24 h時(shí)各項(xiàng)ARDS的癥狀和指標(biāo)達(dá)到高峰,比單獨(dú)行CLP或使用LPS更能模仿ARDS的病理過程,是一種較為理想的動(dòng)物模型。

圖1 24 h各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) HE ×400 A:對(duì)照組;B:CLP組;C:LPS組;D:CLP+LPS組

圖2 24 h各組大鼠肺組織在透射電鏡下的損傷差異 A:對(duì)照組;B:CLP組;C:LPS組;D:CLP+LPS組

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突