缺氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)肺組織急性炎癥的調(diào)控作用研究

張科東 周鳳 付紅艷 馬萍

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,銀川750004;2寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,銀川750001

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的核心轉(zhuǎn)錄因子,在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,目前已發(fā)現(xiàn)有100多個(gè)基因受其調(diào)控,在氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、代謝以及腫瘤細(xì)胞的低氧適應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。低氧可誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá),但低氧并非其唯一誘導(dǎo)因素。有研究表明,在常氧狀態(tài)下,一些炎性因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細(xì)菌代謝產(chǎn)物等也可通過(guò)不同途徑促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)[2]。HIF-1α在胞內(nèi)積聚后,迅速進(jìn)入胞核,促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄,從而在多個(gè)不同的層面對(duì)炎癥發(fā)揮調(diào)控作用,但HIF-1α對(duì)急性炎癥的調(diào)控作用及機(jī)制目前仍不清楚。本研究通過(guò)應(yīng)用HIF-1α基因敲除(Hif-1α+/-)小鼠,建立Hif-1α+/-小鼠的急性肺損傷模型,研究HIF-1α在肺組織急性炎癥中的作用,并初步闡明其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Hif-1α+/-小鼠及其野生型對(duì)照(Hif-1α+/+)小鼠由廣州呼吸疾病健康研究院、呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,6～8周齡,體質(zhì)量20～23 g,無(wú)特定病原體級(jí)環(huán)境中喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)獲得廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,TNF-α和KC檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)E-bioscience公司,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將Hif-1α+/-小鼠及Hif-1α+/+小鼠隨機(jī)分為Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組、Hif-1α+/-對(duì)照組、Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組和Hif-1α+/+對(duì)照組,每組8～10只。

1.3.2 ALI小鼠模型的建立 用1%戊巴比妥麻醉各組小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)鼻滴入LPS 10μg(溶解于50μl生理鹽水),確保LPS全部進(jìn)入氣道及肺泡,建立ALI模型;對(duì)照組小鼠則經(jīng)鼻滴入等量生理鹽水。

1.3.3 提取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF) 分別于6、12、24、48 h將實(shí)驗(yàn)組小鼠及對(duì)照組小鼠再次麻醉,行氣管切開(kāi),插入灌洗管,結(jié)扎后,將磷酸鹽緩沖液0.6 ml注入小鼠肺臟,反復(fù)沖洗2次后回收,連續(xù)3次。混勻后,冰浴,盡快處理,以防BALF中細(xì)胞裂解。

1.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi) 將BALF離心后,上清液保存待檢,收集細(xì)胞,裂解去除紅細(xì)胞后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下統(tǒng)計(jì)總細(xì)胞數(shù)。剩余細(xì)胞涂片后晾干后4%多聚甲醛固定,行HE染色并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法參考文獻(xiàn)[3]。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)BALF中炎性因子TNF-α和KC的表達(dá)水平 雙抗體夾心法檢測(cè)小鼠BALF中的TNF-α和KC水平,具體步驟根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,測(cè)定450 nm吸光度值。

1.3.6 肺組織病理標(biāo)本采集及染色 開(kāi)胸取出小鼠肺臟置入4%多聚甲醛中固定,脫水、石蠟包埋、切片,行HE染色。對(duì)比觀察各組小鼠中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.7 TUNEL檢測(cè)肺組織中凋亡細(xì)胞 將各組小鼠肺組織病理石蠟切片,采用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織中浸潤(rùn)的凋亡細(xì)胞,即中性粒細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α對(duì)BALF中炎性細(xì)胞的影響 對(duì)照組小鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)目 (白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù))極低,隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增加,24 h達(dá)最高峰,48 h出現(xiàn)下降。2組實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中白細(xì)胞中絕大多數(shù)為中性粒細(xì)胞,且白細(xì)胞總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量在24、48 h時(shí)均低于Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組小鼠 (P值均＜0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同時(shí)間Hif-1α+/-小鼠與其野生型ALI模型小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)

圖2 不同時(shí)間Hif-1α+/-小鼠與其野生型ALI模型小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)

2.2 HIF-1α對(duì)BALF中炎性因子的影響 對(duì)照組小鼠BALF中TNF-α和KC表達(dá)水平極低,實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中TNF-α和KC表達(dá)明顯升高。在LPS作用6 h時(shí)TNF-α表達(dá)水平即達(dá)高峰,之后則逐漸下降。在6 h時(shí),Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組小鼠TNF-α表達(dá)水平高于 Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05);其他時(shí)間點(diǎn)則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KC亦在6 h時(shí)表達(dá)水平最高,在12、24 h時(shí)Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組小鼠KC表達(dá)水平高于Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組(P值均＜0.05)。見(jiàn)圖3、4。

圖3 不同時(shí)間Hif-1α+/-小鼠與其野生型ALI模型小鼠BALF中TNF-α的水平

圖4 不同時(shí)間Hif-1α+/-小鼠與其野生型ALI模型小鼠BALF中KC的水平

2.3 HIF-1α對(duì)ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 不同時(shí)間ALI小鼠肺組織均可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),其中24 h ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況最為明顯。Hif-1α+/-小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯多于Hif-1α+/+小鼠。見(jiàn)圖5。

2.4 TUNEL對(duì)凋亡細(xì)胞的檢測(cè) 通過(guò)TUNEL進(jìn)一步檢測(cè)肺組織中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中凋亡的中性粒細(xì)胞數(shù)量均逐漸增多,但Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中凋亡的中性粒細(xì)胞數(shù)量在12、24、48 h明顯多于Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組小鼠 (P值均＜0.05)。對(duì)照組小鼠肺組織則未見(jiàn)有凋亡的中性粒細(xì)胞。見(jiàn)圖6～8。

圖5 HIF-1α對(duì)ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 A:Hif-1α+/-對(duì)照組;B:Hif-1α+/+對(duì)照組;C:Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組;D:Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組 HE ×400

圖6 對(duì)照組及不同時(shí)間Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中凋亡的中性粒細(xì)胞

圖7 對(duì)照組及不同時(shí)間Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中凋亡的中性粒細(xì)胞

圖8 HIF-1α對(duì)ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

HIF-1廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi),是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在機(jī)體的氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧氣輸送以及腫瘤細(xì)胞的低氧適應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[4]。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體。其中α亞基有3種同源體:HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,這3種同源體在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性上有許多相似之處,但HIF-1α在人和小鼠組織中表達(dá)最為廣泛,發(fā)揮的生理作用亦十分復(fù)雜。HIF-1α由826個(gè)氨基酸組成,是主要的調(diào)節(jié)及活性亞基,決定著HIF-1的活性。常氧下,HIF-1α由其結(jié)構(gòu)中的一段氧依賴降解區(qū)域控制,其在泛素-蛋白酶體途徑的作用下被快速降解,幾乎檢測(cè)不到。低氧情況下,HIF-1α在胞內(nèi)積聚、穩(wěn)定及轉(zhuǎn)位,隨之由胞漿進(jìn)入胞核,然后在胞核內(nèi)與結(jié)構(gòu)性亞基HIF-1β形成二聚體,最終HIF-1復(fù)合體形成后即轉(zhuǎn)錄激活,HIF-1α表達(dá)增加。HIF-1β是結(jié)構(gòu)性亞基,不論在低氧或常氧情況下,HIF-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平保持恒定[5]。激活的HIF-1復(fù)合體與低氧反應(yīng)基因的低氧反應(yīng)元件上相應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄,從而引起細(xì)胞對(duì)低氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。此外,HIF-1α可通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥因子及骨髓細(xì)胞的遷移等方式參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),延緩炎癥的吸收。有研究報(bào)道,缺氧可加重ALI大鼠的肺組織炎癥水平[6]。但關(guān)于HIF-1α對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用目前仍不清除。本研究通過(guò)建立Hif-1α+/-小鼠及其野生型小鼠的ALI模型,首次發(fā)現(xiàn)Hif-1α+/-小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量低于野生型小鼠,通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)BALF中炎性因子KC和TNF-α,發(fā)現(xiàn)ALI模型的Hif-1α+/-小鼠BALF中KC和TNF-α均低于其野生型ALI模型小鼠。由此可見(jiàn),HIF-1α部分缺失后,可明顯抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的急性炎癥,但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的急性炎癥是機(jī)體最重要的先天免疫反應(yīng),是機(jī)體防御的主要環(huán)節(jié)。中性粒細(xì)胞在多種趨化因子的作用下,通過(guò)血管壁到達(dá)炎癥病灶,在局部發(fā)揮重要的防御作用。在炎癥反應(yīng)的后期,中性粒細(xì)胞在局部炎性病灶的及時(shí)清除、炎癥反應(yīng)的及時(shí)終止對(duì)組織功能的恢復(fù)至關(guān)重要。有研究認(rèn)為,在炎癥后期,中性粒細(xì)胞的凋亡以及隨后巨噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬是中性粒細(xì)胞最主要的清除方式[6]。此外,部分中性粒細(xì)胞也可通過(guò)逆趨化的方式由炎性部位逆向遷移回血管[7]。對(duì)急慢性肺部炎性疾病而言,部分中性粒細(xì)胞還可經(jīng)組織遷移進(jìn)入氣道,隨痰液被咳出[8]。因此,中性粒細(xì)胞的凋亡及清除對(duì)急性炎癥的預(yù)后至關(guān)重要。有文獻(xiàn)報(bào)道,通過(guò)研究切除尾部的斑馬魚(yú),發(fā)現(xiàn)HIF-1α可抑制中性粒細(xì)胞的凋亡,延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的在炎癥部位的停留時(shí)間,從而延遲炎癥的清除及傷口的愈合[9]。炎癥可導(dǎo)致局部組織環(huán)境出現(xiàn)低氧,從而誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá),而相比于低氧,在常氧狀態(tài)下的細(xì)菌感染是刺激HIF-1α表達(dá)的更強(qiáng)有力的因素[10],而HIF-1α表達(dá)升高后,可通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥因子及骨髓細(xì)胞的遷移及中性粒細(xì)胞的凋亡等方式參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯低于其野生型ALI模型小鼠。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Hif-1α+/-實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),其數(shù)量遠(yuǎn)多于野生型ALI模型小鼠,而這2種ALI模型小鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量則與肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況恰相反。因此,筆者推測(cè),HIF-1α可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞由組織向氣道內(nèi)遷移或促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡等方式抑制BALF中中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

通過(guò)進(jìn)一步行凋亡相關(guān)檢測(cè),筆者發(fā)現(xiàn)ALI模型的Hif-1α+/-小鼠肺組織存在大量凋亡的中性粒細(xì)胞,其數(shù)量明顯多于Hif-1α+/+實(shí)驗(yàn)組,這說(shuō)明HIF-1α能夠抑制ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞的凋亡。由于大量中性粒細(xì)胞在遷移入氣道之前就已發(fā)生凋亡,可部分解釋為什么ALI模型Hif-1α+/-小鼠肺組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),但其BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯卻低于其野生型ALI小鼠。中性粒細(xì)胞凋亡后可被巨噬細(xì)胞吞噬清除,炎癥反應(yīng)快速吸收消散,故 ALI模型 Hif-1α+/-小鼠BALF中炎性因子的表達(dá)水平明顯低于其野生型ALI小鼠。綜上可見(jiàn),HIF-1α可通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)急性炎癥,但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突