HPLC法指紋圖譜在山慈菇真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用

楊紅燕 項(xiàng)微微 李玲燕

臺(tái)州市中醫(yī)院 浙江 臺(tái)州318000

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭或云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖。前者習(xí)稱“毛慈菇”，后二者習(xí)稱“冰球子”，為中國的特有植物。分布在中國大陸的廣西等地，生長于海拔960米至1200米的地區(qū)，多生于山坡林下及溪邊陰濕地，目前尚未有人工引種栽培。其味甘、微辛、性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)的功效，主要用于癰腫疔毒、瘰疬、蛇蟲咬傷等癥[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，目前能從山慈菇中分離得到60 個(gè)單體化合物，對治療腫瘤具有較好的療效。

作為價(jià)格比較高的山慈菇，存在著摻假現(xiàn)象，尤其是粉末。筆者曾對浙江省山慈菇飲片質(zhì)量情況進(jìn)行調(diào)查分析，共收集浙江省11個(gè)市涉及35家生產(chǎn)企業(yè)的87批次樣品，涉及生產(chǎn)、經(jīng)營及醫(yī)療各行業(yè)單位。按《中國藥典》2015 年版一部法定標(biāo)準(zhǔn)性狀鑒別和顯微鑒別進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合格率僅為82.8%，而偽品大多數(shù)為山蘭、扁白及等山慈菇同科品種?！吨袊幍洹穬H只有性狀、顯微鑒別與SO2殘留三項(xiàng)檢查，尚無相關(guān)專屬性鑒別方法和定量標(biāo)準(zhǔn)。由于現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置過于簡單，且尚無山慈菇專屬性鑒別方法和定量標(biāo)準(zhǔn)，對于切片加工后的飲片鑒別方面仍存在一定的局限性。中藥指紋圖譜是一種從整體上對中藥進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)建立了重要的模式，已經(jīng)成為國內(nèi)外公認(rèn)的控制中藥材和天然藥物質(zhì)量最有效的方法，被更多人采納。因此本文擬通過建立山慈菇高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，對其相關(guān)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，以此直觀判斷山慈菇藥品的真?zhèn)危瑸檫M(jìn)一步提高山慈菇質(zhì)量水平提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：Waters e2695 液相色譜儀（美國沃特世公司，2998 PDA 檢測器和Empower2 色譜工作站），BP221S型電子天平（德國賽多利斯），恒溫水浴鍋（江蘇金壇市江南儀器廠）。

1.2 試劑與材料：乙腈為色譜純，磷酸、甲醇、乙醇、氨水均為分析純，水為去離子水。10 批山慈菇（冰球子）樣品性狀經(jīng)臺(tái)州市藥品檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)所鑒定，均符合《中國藥典》2015年版一部規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，并經(jīng)過液相條件的摸索，按照高效液相色譜法（《中國藥典》2015 年版四部0512），擬建立如下HPLC指紋圖譜方法。

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相；檢測波長為224nm。理論板數(shù)按1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine）峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 供試品溶液的制備：取本品粉末（過四號(hào)篩）1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100ml，浸泡1 小時(shí)，然后超聲處理（功率240W，頻率45kHz）1 小時(shí)，放冷，用干燥濾器過濾，殘?jiān)?0%甲醇淋洗后合并，將濾液濃縮并轉(zhuǎn)移到20ml 量瓶中，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法：分別精密吸取各供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

在以上液相條件下，得到山慈菇（冰球子）及各類樣品的HPLC 指紋圖譜，見圖2。得到共有峰7 個(gè)，經(jīng)過對照品比對，指認(rèn)含量最高的峰為militarine，作為參考峰。相似度均大于0.990（見圖1）。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察：分述如下。

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液（樣3），按“2.3”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征圖譜。將測量結(jié)果采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A 版）”軟件處理，結(jié)果表明，其相似度均＞0.95，符合特征圖譜技術(shù)要求，精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品（樣3）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定。將測量結(jié)果采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A 版）”軟件處理，結(jié)果表明，其相似度均＞0.95，符合特征圖譜技術(shù)要求，重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品（樣3）溶液在0、4、12、24h 分別進(jìn)樣，依法測定。將測量結(jié)果采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A 版）”軟件處理，結(jié)果表明，其相似度均＞0.95，表明樣品供試品溶液在24h內(nèi)檢測結(jié)果無影響，穩(wěn)定性良好。

圖1 山慈菇（冰球子）HPLC指紋圖譜

3 山慈菇HPLC指紋圖譜在真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用

中藥材市場上山慈菇的偽品較多，較難鑒別，因此建立了冰球子及其偽品白及、山蘭、扁白及的HPLC 圖譜，比較指標(biāo)成分Militarine 的峰值大小，并通過其它相似性分析，可以很好地對冰球子及其偽品白及、山蘭、扁白及的來源進(jìn)行鑒別，詳見圖2。

4 討論

militarine 成分為山慈菇及其偽品山蘭共有成分，但含量卻有所差別，本課題比較了10個(gè)批次山慈菇（冰球子）中militarine 的含量，建立了山慈菇HPLC 指紋圖譜。而HPLC 指紋圖譜的建立，則可以為毛慈菇、冰球子及偽品白及、山蘭、扁白及的來源鑒別提供一定的依據(jù)，從而可以直觀地鑒別山慈菇藥品的真?zhèn)?。本文雖采用HPLC 法建立特征指紋圖譜，卻只測定了其中一個(gè)指標(biāo)成分的含量，沒有測定多個(gè)指標(biāo)成分的含量，不能從整體上評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量，且沒有研究考察不同年份、不同產(chǎn)地、不同采收期山慈菇各指標(biāo)成分的動(dòng)態(tài)變化，會(huì)影響特征指紋圖譜的重現(xiàn)性，因此在后期的相關(guān)研究中，筆者會(huì)在本研究基礎(chǔ)上，對山慈菇的質(zhì)量控制進(jìn)行更深層次的探索。

圖2 冰球子及其偽品的HPLC圖譜