月季鹽脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因RcMYB102的克隆及表達(dá)分析

包穎 李澤卿 魏琳燕 陳超 付玲 張紅心

摘要：為研究月季MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因RcMYB102的生物學(xué)功能，以月季品種月月粉為材料，利用生物信息學(xué)分析和實時熒光定量PCR技術(shù)研究RcMYB102基因在鹽處理、激素處理、鹽加激素共處理下不同組織不同處理時間的表達(dá)特性?？寺〉玫揭粋€MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為RcMYB102，該基因全長為1 492 bp，開放閱讀框（ORF）為1 086 bp，編碼362個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn)，RcMYB102在N端具有保守的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明RcMYB102與梅花PmMYB6、桃PpMYB6、甜櫻桃PaMYB102、蘋果MdMYB74、枇杷EjMYB4處于同一分支，屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。實時熒光定量PCR結(jié)果表明：在鹽脅迫下，外施水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）可誘導(dǎo)RcMYB102的表達(dá)，且均高于單鹽脅迫處理和激素處理。上述結(jié)果表明，RcMYB102可能與SA和MeJA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，推測其在月季響應(yīng)鹽脅迫過程中起到一定的作用。

關(guān)鍵詞：月季;鹽脅迫;RcMYB102;實時熒光定量PCR;基因表達(dá)

中圖分類號：S685.12文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1521-08

Abstract： In order to predict the biological function of transcription factor gene RcMYB102 in Rosa chinensis， the Rosa chinensis Old Blush was used as the material， the bioinformatics analysis of RcMYB102 was conducted and its expression characteristics in diverse tissues under salt， hormone， and salt combined with hormore treatments were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. A MYB transcription factor gene in R. chinensis was obtained and named RcMYB102. The results of bioinformatic analysis showed that the full length of RcMYB102 gene was 1 492 bp， and the open reading frame（ORF） of RcMYB102 was 1 086 bp. Moreover， RcMYB102 gene encoded 362 amino acids. Results of sequence clignment revealed that RcMYB102 had a conserved R2R3-MYB domain at the N-terminal. Phylogenic tree analysis showed that RcMYB102 was clustered with PmMYB6， PpMYB6， PaMYB102， MdMYB74 and EjMYB4， and belonged to the R2R3-MYB transcription factor. Real-time PCR results indicated that， under salt stress， RcMYB102 was significantly up-regulated by salicylicacid （SA） and methyl jasmonate （MeJA）， and the expression levels were higher than those under salt stress treatment and exogenous hormone treatment. These results indicate that RcMYB102 may be related to signal transduction pathways of SA and MeJA， suggesting that RcMYB102 may play a role in response to the salt stress in R. chinensis.

Key words：Rosa chinensis;salt stress;RcMYB102;real-time fluorescence quantitative PCR;gene expression

在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子是數(shù)量最大、功能最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。它們在植物的生長發(fā)育、次生代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物的非生物脅迫反應(yīng)中都起著重要的作用[1-2]。在植物中，R2R3-MYB類型的MYB類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量較多[3]，且參與了植物的初生和次生代謝、植物細(xì)胞形態(tài)和模式建成以及植物生長發(fā)育等多個生命過程的調(diào)節(jié)[4-5]。

越來越多的報道證實MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物逆境應(yīng)答響應(yīng)，包括生物逆境和非生物逆境，且與植物響應(yīng)高鹽脅迫密切相關(guān)[6-7]。在小麥（Triticum aestivum）中有14個MYB基因表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，2個MYB基因表達(dá)受鹽脅迫抑制[8];水稻（Oryza sativa）中有14個MYB基因表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo);擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在197個MYB基因，其中35.02%的MYB基因在鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，56.85%的MYB基因在鹽脅迫下下調(diào)表達(dá)[9];甜瓜（Cucumis melo）幼苗有6個MYB基因的表達(dá)量在鹽脅迫下發(fā)生了明顯的變化[10];在花生（Arachis hypogaea）的根中至少有8個MYB基因在鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)[11]。大量研究結(jié)果表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子還參與對植物激素的應(yīng)答反應(yīng)。如在大豆（Glycine max）中GmMYBJ6的表達(dá)受到脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和萘乙酸 （NAA）的誘導(dǎo)[12];在甜櫻桃（Prunus avium）葉片中PacMYBA的表達(dá)受鹽、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）的誘導(dǎo)[13]。大量研究結(jié)果表明水楊酸和茉莉酸作為重要的化學(xué)信號，均能激活很多防衛(wèi)反應(yīng)[14]。內(nèi)源與外源的水楊酸、茉莉酸均有誘導(dǎo)植物的獲得性抗性的作用，提高植物對生物和非生物逆境脅迫的抗性，如誘導(dǎo)月季抗黑斑病，緩解重金屬對植物的毒害作用，提高植物抗鹽脅迫能力等作用[15-16]。

月季（Rosa hybrida）是薔薇科薔薇屬多年生常綠木本植物。月季被譽為“花中皇后”，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，是世界第一大切花和重要園林花卉[17]。切花生產(chǎn)中設(shè)施內(nèi)土壤鹽漬化問題限制了月季切花的品質(zhì)和產(chǎn)量。此外，鹽堿地區(qū)的環(huán)境脅迫嚴(yán)重制約了月季在當(dāng)?shù)貓@林綠化中的應(yīng)用，高鹽脅迫導(dǎo)致大多數(shù)月季品種生長不良、病蟲害加重，嚴(yán)重影響月季的生長發(fā)育和觀賞效果。目前對于月季耐鹽性的研究遠(yuǎn)滯后于花色、花型、花香等其他農(nóng)藝性狀。國內(nèi)外對月季抗鹽性的研究主要集中在形態(tài)和生理水平上，而在分子水平上對于月季耐鹽性的研究較少[18-20]。關(guān)于月季鹽脅迫分子機理的解析和發(fā)掘抗鹽的月季品系已成為當(dāng)下首要解決的問題。大量研究結(jié)果表明在鹽堿土中，植物在承受鹽脅迫的同時還要抵御高pH脅迫傷害。NaHCO3或Na2CO3等堿性鹽脅迫對植物所造成的破壞作用明顯大于由NaCl或Na2SO4等中性鹽所造成的脅迫傷害[21]。同時關(guān)于植物抗鹽特性的研究多集中在草本植物，且多以NaCl為脅迫因子，關(guān)于NaHCO3脅迫下木本植物抗鹽特性的研究相對較少[22]。

前期我們利用月季品種月月粉在高鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選獲得1個表達(dá)水平具有顯著性差異的MYB類基因RcMYB102。為驗證月季品種月月粉轉(zhuǎn)錄因子基因RcMYB102是否參與高鹽脅迫逆境應(yīng)答，本研究分析RcMYB102基因?qū)}脅迫以及抗性相關(guān)的激素分子（MeJA和SA）的誘導(dǎo)表達(dá)模式，同時進(jìn)一步對月季RcMYB102進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對其基本生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測，為深入剖析月季的抗鹽機制和培育新的抗鹽堿品種提供重要基因源和理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

中國二倍體古老月季品種月月粉（Rosa chinensis Old Blush） ，購自昆明楊月季園藝有限責(zé)任公司，并將其栽植于唐山師范學(xué)院溫室內(nèi)培養(yǎng)。選用生長狀況良好、植株健壯、無病蟲害、株高25 cm左右的當(dāng)年生月季扦插生根的幼苗進(jìn)行試驗。

1.2材料處理

先在每個栽培槽中用10 L的1/2 Hoagland營養(yǎng)液緩苗1周。之后用全Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫（200 mmol/L NaHCO3）、激素處理（1 μmol/L MeJA、200 μmol/L SA）和鹽加激素共同處理（200 mmol/L NaHCO3+1 μmol/L MeJA、200 mol/L NaHCO3+200 μmol/L SA），每個處理分別在0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h對月季根系和葉片進(jìn)行取樣，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€處理5株，3次重復(fù)。鹽處理濃度參照丁晗[23]的研究結(jié)果，MeJA處理濃度參照嚴(yán)加坤等[24]的研究結(jié)果，SA處理濃度參照付乃鑫等[25]的研究結(jié)果。

1.3總RNA提取與cDNA合成

RNA的提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的步驟參照Roche公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒。上述操作過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4RcMYB102基因的克隆

以月季品種月月粉生根的組培苗為材料，進(jìn)行RcMYB102基因的克隆。根據(jù)前期鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（SRA accession：PRJNA587482;ID：SUB6482523）和月季全基因組數(shù)據(jù)[26]，檢索序列號RC5G0056400，以月季品種月月粉cDNA序列為模板設(shè)計CDS全長擴增特異引物（表1） ，并進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為10×KOD Buffer 5.0 μl，MgSO4 3.0 μl，dNTPs 5.0 μl，cDNA 1.0 μl，上、下游引物各1.5 μl，KOD Plus高保真酶1.0 μl，用無菌ddH2O補齊至20 μl?；靹螂x心后放于PCR儀中進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)程序：94.0 ℃ 2 min;94.0 ℃ 15 s，56.1 ℃ 30 s，68.0 ℃ 1 min，以上程序35個循環(huán);68.0 ℃ 5 min，4 ℃反應(yīng)終止。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit 試劑盒（大連TaKaRa公司產(chǎn)品）回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將鑒定出的陽性克隆交由諾賽生物工程有限公司測序。

1.5月季轉(zhuǎn)錄因子基因RcMYB102的生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（SRA accession： PRJNA587482; ID： SUB6482523）和月季全基因組數(shù)據(jù)[26]，獲取RcMYB102基因CDS和基因全長序列。根據(jù)所獲得的RcMYB102基因cDNA和基因全長序列，使用DNAMAN軟件分析RcMYB102氨基酸序列同源性，使用clutaLX進(jìn)行氨基酸序列比對分析，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.6實時熒光定量PCR分析

采用軟件Primer5.0設(shè)計RcMYB102的實時熒光定量引物，內(nèi)參基因為RcActin，引物序列見表1。RcMYB102基因的表達(dá)量在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。20 μl反應(yīng)體系：3 μl cDNA模板，1 μl上游引物，1 μl下游引物，10 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×），5 μl ddH2O。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸2 min，40個循環(huán)。每處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)。相對表達(dá)量采用2-△△Ct[△Ct=CtRcMYB102-CtRcActin，△△Ct=△Ct（x h）-△Ct（0 h）]計算，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

SA和MeJA是植物中重要的信號分子，在植物防御反應(yīng)中起著重要的作用。前人研究結(jié)果表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物激素應(yīng)答過程。如小麥的TaMYB4基因的表達(dá)受到了SA、ABA和MeJA的調(diào)控[35];在外源激素SA、ABA、MeJA和GA3處理下，白木香（Aquilaria sinensis）的AsMYB1、AsMYB2基因被誘導(dǎo)表達(dá)[36]。本研究結(jié)果顯示，外源激素SA和MeJA都可以誘導(dǎo)月季RcMYB102基因的表達(dá)，且葉中的表達(dá)量相對較高，表明葉片對于外源激素SA和MeJA的響應(yīng)更為敏感，RcMYB102基因主要在月季葉片中發(fā)揮生物學(xué)功能。

植物激素除了參與植物的生長發(fā)育，還會響應(yīng)非生物脅迫如干旱、鹽漬和低溫等[37-40]。如外施適量的水楊酸和茉莉酸甲酯使龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）中的HSP70、MnSOD、CA、NR基因的表達(dá)量提高，并且施用這2種激素均可以提高龍須菜抵抗高溫的能力[41];在煙草（Nicotiana tabacum）中，外施SA時MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量會顯著升高，同時煙草中抗病相關(guān)蛋白質(zhì)含量也會增加[42];Hussain等研究結(jié)果顯示，外施赤霉素可以誘導(dǎo)擬南芥中MYB基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其花藥育性和開花時間[43]。本研究對月季在高鹽與SA共處理以及高鹽和MeJA共處理下RcMYB102基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫與外施激素共同處理下，在月季根和葉片中，RcMYB102基因的表達(dá)水平比高鹽和激素單獨處理時都要明顯升高，且在鹽脅迫下增施MeJA 較增施SA的誘導(dǎo)效果更加明顯。前期研究結(jié)果也證明，鹽脅迫處理48 h，月季品種月月粉幼苗基部葉片明顯褐化死亡，外施MeJA和SA均可以減緩鹽脅迫對月季品種月月粉幼苗的傷害[44]。由此可以推斷MeJA和SA參與了月季品種月月粉響應(yīng)高鹽脅迫過程。本研究對RcMYB102基因的生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析有利于揭示月季的耐鹽機制，同時為月季遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，作為典型的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子RcMYB102，參與了月季鹽脅迫響應(yīng)和對激素SA和MeJA的應(yīng)答過程，可能對月季體內(nèi)激素信號的接受、傳導(dǎo)和高鹽脅迫應(yīng)答機制具有重要的作用。該結(jié)果為深入剖析月季的抗鹽機制和培育新的抗鹽堿品種提供了重要基因源和理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張震林）