生物有機(jī)肥對(duì)熱區(qū)烤煙根際土壤酚酸類物質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

楊敏 曹敬東 鄭元仙 王繼明 許銀蓮 和明東 周厚發(fā) 段杰 閆鼎 蔡憲杰 童文杰 陳小龍 余磊 何元?jiǎng)?/p>

摘要：為探明生物有機(jī)肥對(duì)熱區(qū)烤煙栽培根際微生態(tài)的影響方式及作用規(guī)律，以云南熱區(qū)連作植煙根際土壤為研究對(duì)象，采用HPLC檢測(cè)和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分析不同施肥處理對(duì)烤煙根際土壤中7種酚酸及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，2種生物有機(jī)肥處理（T1、T2）均可降低烤煙根際土壤中酚酸類自毒物質(zhì)的含量，與CK相比，T1處理烤煙根際土壤中對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、4-香豆酸的含量分別顯著降低了33.33%、26.11%、19.51%（P<0.05），T2處理分別顯著降低了27.50%、28.03%和19.92%（P<0.05）;T1、T2處理的酚酸類物質(zhì)總量較CK分別顯著降低了12.15%和10.61%（P<0.05）;施肥處理后有利于提升烤煙根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)，與CK相比，T1、T2處理的OTU豐度分別增加了8.06%和14.48%、Shannon指數(shù)分別增加了0.49%和2.95%、ACE指數(shù)分別增加了5.21%和16.50%、Chao1指數(shù)分別增加了4.46%和15.23%;不同施肥處理細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群和相對(duì)豐度有差異，T1處理中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的相對(duì)豐度分別較CK增加了91.72%、106.94%和27.48%，同樣，T2處理中上述三者相對(duì)豐度較CK分別增加了46.03%、101.73%和39.69%。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析表明，烤煙根際土壤中酚酸類自毒物質(zhì)的含量與部分土壤細(xì)菌群落有顯著相關(guān)性，其中鞘氨醇單胞菌屬、假節(jié)桿菌屬與對(duì)羥基苯甲酸、4-香豆酸以及酚酸物質(zhì)總量均呈顯著負(fù)相關(guān);芽孢桿菌屬（Bacillus）、慢生根瘤菌屬分別與阿魏酸、丁香酸和4-香豆酸亦呈顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明生物有機(jī)肥對(duì)植煙土壤有一定的改良與提質(zhì)效應(yīng)，有利于創(chuàng)造健康的根際微生態(tài)環(huán)境，研究可為生物有機(jī)肥在云南熱區(qū)煙田有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烤煙;連作障礙;生物有機(jī)肥;酚酸類物質(zhì);細(xì)菌群落

中圖分類號(hào)：S154 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0244-08

烤煙是典型的忌連作作物，大量研究表明，連作會(huì)導(dǎo)致植煙土壤養(yǎng)分失衡、酶活性變化、微生物多樣性降低，自毒物質(zhì)積累等一系列土壤問(wèn)題[1-2]，進(jìn)而導(dǎo)致煙株?duì)I養(yǎng)失調(diào)、土傳病害嚴(yán)重發(fā)生等生產(chǎn)問(wèn)題，從而影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。因此，探明連作障礙的發(fā)生原因并采取有效措施緩解連作障礙對(duì)煙葉健康生產(chǎn)具有重要理論與實(shí)際意義。研究指出，連作障礙的形成及加重是根際土壤系統(tǒng)內(nèi)部諸多因素綜合作用的外在表現(xiàn)，煙草連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡、土壤理化特性惡化，造成土壤中化感類自毒物質(zhì)的積累，這些物質(zhì)對(duì)土壤微生物特別是病原微生物的選擇性促進(jìn)，以及由此導(dǎo)致的根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡，是煙草連作障礙產(chǎn)生的主要原因[4-5]。酚酸類物質(zhì)是作物根系所分泌的連作主要障礙物，對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及植物生長(zhǎng)均可產(chǎn)生較大影響[6-7];而根際土壤微生物作為土壤中生理活性最強(qiáng)的部分其群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性直接影響植物對(duì)水分、養(yǎng)分的吸收，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密不可分[8-9。然而，研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)在植煙土壤中表現(xiàn)出一定的富集效應(yīng)，隨連作年限增加植煙土壤中酚酸類物質(zhì)總含量表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)[10，且酚酸物質(zhì)的積累與植煙土壤理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度具有極顯著相關(guān)性[11。總體看來(lái)，酚酸類物質(zhì)在連作植煙土壤中積累在某種程度上加重了煙草連作障礙的發(fā)生。

臨滄植煙區(qū)位于中國(guó)云南的西南邊陲，主要為熱帶、亞熱帶季風(fēng)氣候類型（熱區(qū)），干雨季分明，雨水較多，太陽(yáng)輻射較為豐富，為全國(guó)新開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)煙區(qū)之一。但連作導(dǎo)致臨滄植煙土壤不斷酸化、有機(jī)質(zhì)含量下降及土傳病害普遍發(fā)生等一系列問(wèn)題，嚴(yán)重制約了臨滄煙草經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。通過(guò)土壤調(diào)理修復(fù)來(lái)克服連作障礙已成為近幾年研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，生物有機(jī)肥中含有豐富的有機(jī)質(zhì)及大量微生物活體，對(duì)土壤的保水性、保肥性、緩沖性和通氣狀況有較好的協(xié)調(diào)和改善作用，既可增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤肥力[12];又能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，改善土壤質(zhì)地[13-14];還能促進(jìn)作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、作物生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量。近年來(lái)，生物有機(jī)肥在土壤保育方面已受到越來(lái)越多的關(guān)注，但現(xiàn)有報(bào)道多是關(guān)于生物有機(jī)肥對(duì)土壤理化性狀的改良及作物生長(zhǎng)品質(zhì)的影響，生物有機(jī)肥對(duì)煙草根際土壤酚酸類自毒物質(zhì)積累的影響目前尚不明確，因此，本試驗(yàn)欲通過(guò)生物有機(jī)肥調(diào)理修復(fù)連作植煙土壤，同時(shí)探明其對(duì)連作烤煙根際土壤酚酸類物質(zhì)及細(xì)菌群落的影響，為進(jìn)一步克服化感自毒引起的熱區(qū)烤煙連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集區(qū)基本概況

試驗(yàn)于2018年4—12月在云南省臨滄市耿馬縣勐撒鎮(zhèn)云煙87烤煙的植煙區(qū)（99°23′22″ E，23°33′40″ N）進(jìn)行，選取連作障礙嚴(yán)重的煙田，試驗(yàn)區(qū)植煙土壤類型為紅壤，土壤質(zhì)地為輕黏土，前茬作物為玉米，翻耕前0～20 cm 土層土壤理化性狀為：pH值4.69;有機(jī)質(zhì)29.13 g/kg;水解性氮155.28 mg/kg;銨態(tài)氮2.48 mg/kg;有效磷 8.84 mg/kg;速效鉀145.97 mg/kg;烤煙品種為云煙87。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，CK組表示當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥（單施煙草專用復(fù)合肥，施基肥600 kg/hm2，養(yǎng)分含量49%，N、P2O5、K2O含量分別為10%、14%、25%;追肥300 kg/hm2，養(yǎng)分含量45%，N、P2O5、K2O含量分別為15%、0、30%;T1組表示煙草專用復(fù)合肥減量10%（施基肥540 kg/hm2，追肥270 kg/hm2）+生物有機(jī)肥A 150 g/株（青島海大生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，有機(jī)質(zhì)含量≥45%，總養(yǎng)分≥5%，水分≤30%，有效活菌數(shù)≥2.0億/g）;T2組表示煙草專用復(fù)合肥減量10%（施基肥540 kg/hm2，追肥 270 kg/hm2）+生物有機(jī)肥B 150 g/株（昆明神瑞農(nóng)業(yè)投資有限公司生產(chǎn)，有機(jī)質(zhì)含量≥40%，總養(yǎng)分≥5%，水分≤30%，有效活菌B數(shù)≥2.0億/g），生物有機(jī)肥于移栽當(dāng)天作為基肥拌塘施用。在常規(guī)栽培管理措施如耕作、排灌、密度、防治病蟲(chóng)害等一致的前提下，采用隨機(jī)區(qū)組排列試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)每處理3次重復(fù)，常規(guī)單壟移栽，行距 1.2 m，株距 0.6 m，移栽后壟高20.0 cm，每處理種植100株。

樣品采集：于旺長(zhǎng)期按5點(diǎn)取樣法選取煙株，去除表層土后將煙株整株拔起，抖落較松散的土壤，然后收集附著在根上0～4 mm間的土壤作為根際土，去除土樣中的雜物、細(xì)根后混勻放入自封袋中，混勻的土樣分2份，一份自然風(fēng)干保存，一份于 -80 ℃ 冰箱內(nèi)保存，用于土壤酚酸類物質(zhì)和土壤微生物的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤酚酸類物質(zhì)的測(cè)定 土壤酚酸類化合物的測(cè)定采用液相色譜法（HPLC）進(jìn)行。供試烤煙根際土壤風(fēng)干，除去須根等雜物，過(guò)40目篩，稱取50 g置于250 mL具塞三角瓶中，加入150 mL 2 mol/L NaOH，120 r/min振蕩提取3 h，靜置3 h，采用濾紙過(guò)濾。取上清液用5 mol/L HCl調(diào)至pH值為2.5。然后采用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，45 ℃蒸干，殘?jiān)捎? mL色譜純甲醇溶解，4 ℃避光保存[15]。過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

儀器為Waters超高效液相色譜儀，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）;流動(dòng)相A：0.3%乙酸水溶液;流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫：0 min，流動(dòng)相A 95%，B 5%;1 min，流動(dòng)相A 80%，B 20%;5 min，流動(dòng)相A 70%，B 30%;7.5 min，流動(dòng)相A 20%，B 80%;10 min，流動(dòng)相A 95%，B 5%;流速為 0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL。每個(gè)周期分析結(jié)束后，等待1 min，以便去除干擾成分的影響，保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.3.2 土壤細(xì)菌多樣性的測(cè)定

1.3.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增 參照FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，USA）土壤基因組DNA提取試劑盒的步驟提取各根際土壤樣品DNA，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rDNA基因 V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，27個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu 緩沖液;2 μL 2.5 mmol/L dNTPs;0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L）;0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L）;0.4 μL FastPfu 聚合酶;0.2 μL BSA;10 ng DNA模板;加ddH2O至20 μL。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen USA））試劑盒進(jìn)一步純化回收后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq測(cè)序。

1.3.2.2 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析 剔除標(biāo)簽序列（Barcode）和引物序列，用FLASH[17]軟件進(jìn)行序列拼接;通過(guò)Usearch軟件（Version 7.0）過(guò)濾得到的序列，并去除嵌合體序列得到有效序列;采用Uparse[18]軟件（Version 7.1）在97%的相似性水平上劃分操作分類單元;代表序列用RDP classifier軟件[19]和SILVA[20]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，利用Mothur軟件（Version v.1.30.1）作稀釋度曲線，計(jì)算文庫(kù)覆蓋率（Coverage），Shannon、Simpson、ACE及Chao1指數(shù)，對(duì)物種的多樣性和豐富度指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià);利用Qiime軟件（Version 1.7.0）建立的Bray-Curtis距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）;利用R語(yǔ)言中的Vegan軟件作圖進(jìn)行RDA冗余分析，檢測(cè)環(huán)境因子、樣本、菌群三者間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系;通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算不同環(huán)境因子與微生物物種組成的關(guān)系，利用相關(guān)性heatmap圖評(píng)估微生物分類與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥對(duì)煙草根際土壤酚酸類物質(zhì)的影響

由表1可知，不同施肥處理烤煙根際土壤中均檢測(cè)出6種酚酸類物質(zhì)，分別為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸。除肉桂酸變化不明顯外，不同處理各酚酸物質(zhì)的含量有明顯差異，施用生物有機(jī)肥能降低植煙土壤中部分酚酸物質(zhì)的含量，T1處理的對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、4-香豆酸的含量較CK分別降低了33.33%、26.11%、19.51%，差異顯著（P<0.05）;T2處理較CK降低了27.5%、28.03%和19.92%（P<0.05）。生物有機(jī)肥處理后烤煙根際土壤中酚酸物質(zhì)的總量均低于常規(guī)施肥處理，T1、T2處理酚酸物質(zhì)總量較CK分別降低了12.15%和10.61%（P<0.05）。以上結(jié)果表明，生物有機(jī)肥能在一定程度上降低烤煙根際土壤中酚酸物質(zhì)的含量，減少化感自毒作用。

2.2 生物有機(jī)肥對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌群落的影響

2.2.1 細(xì)菌的OTU豐度和Alpha多樣性 在 97% 相似水平上土壤樣品細(xì)菌群落OTU豐度和多樣性指數(shù)，由表2可知，OTUs 豐度稀釋度曲線（圖1）顯示，隨著測(cè)序數(shù)量的上升，稀釋度曲線斜率逐漸下降，趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量足夠。覆蓋率（Coverage）是指樣本中序列被檢測(cè)出的概率，其值越高，代表本次測(cè)序結(jié)果越符合樣本中微生物的實(shí)際情況，在本試驗(yàn)中，3個(gè)處理的覆蓋率分別為 98.62%、98.39%和98.20%（表2），表明測(cè)序讀長(zhǎng)足以進(jìn)行此項(xiàng)分析。

CK、T1、T2處理根際土壤樣品中細(xì)菌的OTU豐度分別為2 396個(gè)、2 589個(gè)和2 743個(gè)（表2），T1、T2處理的OTU豐度分別較CK增加了8.06%和14.48%。細(xì)菌OTUs分布韋恩圖（圖2）表明，3個(gè)處理根際土壤中一共有7 728個(gè)OTUs，三者共有的OTUs為1 942個(gè)，只占OTUs總數(shù)的25.13%;CK、T1、T2處理根際土壤樣品中特有的細(xì)菌OTUs數(shù)分別為105、165和234個(gè)，分別占各自總數(shù)的4.38%、6.37%和8.53%;且T1、T2處理特有的OTUs數(shù)分別為CK的1.57倍和2.23倍。說(shuō)明不同處理根際細(xì)菌群落在 OTUs 水平上存在明顯差異。此外，生物有機(jī)肥對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度均有影響，T1、T2處理的Shannon指數(shù)較CK分別增加了0.49%和2.95%;Simpson指數(shù)分別降低了3.23%和16.13%，說(shuō)明，施用生物有機(jī)肥能增加煙草根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性（Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，群落多樣性越高）。除群落多樣性外，施用生物有機(jī)肥還能提高煙草根際土壤中細(xì)菌群落的豐富度，與CK相比，T1、T2處理的ACE指數(shù)分別增加了5.21%和16.50%;Chao1指數(shù)分別增加了4.46%和15.23%。

2.2.2 細(xì)菌的群落種類組成及相對(duì)豐度 根據(jù)各OTU中代表序列的物種注釋結(jié)果，選取各處理根際土壤樣品中細(xì)菌在門（Phylum）分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度堆積柱形圖（圖3）。由圖3可知，3個(gè)處理根際土壤中細(xì)菌在門的分類水平上，最大豐度排名前10的種類為：變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、Patescibacteria、WPS-2、破壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉?fàn)罹T（Planctomycetes）。CK、T1、T2處理細(xì)菌區(qū)系在門水平上的組成相似，主要由變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門組成，四者含量分別占各自總量的80.46%、81.34%和83.79%。進(jìn)一步分析處理間差異表明，生物有機(jī)肥對(duì)部分群落的相對(duì)豐度有影響，生物有機(jī)肥處理的變形菌門、放線菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度均高于常規(guī)施肥處理（CK），T1處理三者的相對(duì)豐度較CK分別增加了27.03%、20.92%和35.90%，T2處理較CK分別增加了15.94%、12.68%和69.23%。有機(jī)肥處理中綠彎菌門、WPS-2和破壁菌門的相對(duì)豐度較常規(guī)施肥處理（CK）降低，T1處理三者的相對(duì)豐度較CK分別減少了28.03%、16.74%和41.04%;T2 處理減少了13.87%、35.68%和51.93%。

不同處理屬水平上細(xì)菌群落組成差異分析（圖4）表明，在相對(duì)豐度排名前20的物種中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為生物有機(jī)肥處理高于常規(guī)施肥處理（CK），T1處理中三者相對(duì)豐度分別較CK增加了91.72%、106.94%和27.48%，T2處理中三者相對(duì)豐度較CK增加了46.03%、101.73%和39.69%;與此相反，生物有機(jī)肥處理中熱酸菌屬（Acidothermus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度卻低于常規(guī)施肥處理（CK），T1處理較CK降低了55.88%和59.69%，T2處理較CK降低了44.12%和55.10%。綜上所述，2種生物有機(jī)肥處理（T1、T2）間差異不顯著，但與常規(guī)施肥處理中煙株根際土壤細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度均存在明顯差異。

2.2.3 生物有機(jī)肥對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌的群落構(gòu)成的影響 PCoA 主成分分析（圖5）表明，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)樣品差異性的解釋度分別為40.75%和20.64%，兩者總計(jì)可解釋全部土壤樣品的61.39%。由圖5可知，T1和T2處理共同分布在PC1的正值區(qū)域，雖然T1處理分布PC2的0值和正值區(qū)域、T2處理均分布PC2的負(fù)值區(qū)域，但二者的距離相對(duì)較近，說(shuō)明2種生物有機(jī)肥處理的細(xì)菌物種組成更為相似;總體看來(lái)，T1和T2處理主要分布在PC1的正值區(qū)域，而CK主要分布在PC1的負(fù)值區(qū)域，且間隔距離較大，進(jìn)一步說(shuō)明生物有機(jī)肥處理與常規(guī)施肥處理煙株根際土壤細(xì)菌物種組成存在明顯差異。

2.3 烤煙根際土壤細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

RDA分析即冗余分析，是環(huán)境因子約束化的PCA分析，可以將樣本和環(huán)境因子反映在同一個(gè)二維排序圖上，直觀地反映出環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系。環(huán)境因子（酚酸類物質(zhì)）、優(yōu)勢(shì)菌群（屬水平）和不同處理間的關(guān)系如圖6所示，圖中RDA 1和RDA 2兩軸對(duì)樣品的解釋度分別為40.83%和14.55%，兩軸累計(jì)解釋度為55.38%。由圖6可知，不同酚酸物質(zhì)之間呈不同程度的相關(guān)性，對(duì)羥基苯甲酸（PHA）、丁香酸（SA）和4-香豆酸（CA）兩兩呈正相關(guān)性，但三者與香草酸（VA）和阿魏酸（FA）均呈負(fù)相關(guān)性;香草酸（VA）與阿魏酸（FA）亦呈負(fù)相關(guān)。酚酸物質(zhì)的含量對(duì)菌群分布有一定的影響，其中香草酸（VA）的影響程度大于其余4種酚酸。

進(jìn)一步利用 Spearman 相關(guān)系數(shù)計(jì)算不同環(huán)境因子與微生物群落組成的關(guān)系，由環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成相關(guān)性熱圖可以看出（圖7），屬水平上相對(duì)豐度排名前20的物種中，熱酸菌屬（Acidothermus）與對(duì)羥基苯甲酸、酚酸物質(zhì)總量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.828、0.833;芽孢桿菌屬（Bacillus）與阿魏酸呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 -0.667;鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）與對(duì)羥基苯甲酸、酚酸物質(zhì)總量以及4-香豆酸呈顯著負(fù)相關(guān)，與阿魏酸呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.711、-0.700、-0.762和0.667;假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）與對(duì)羥基苯甲酸、酚酸物質(zhì)總量以及4-香豆酸呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.703、-0.717和-0.695;慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）與丁香酸和4-香豆酸呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.672和-0.787。此外，一些未被準(zhǔn)確分類命名的細(xì)菌類群，如unclassified_f_Intrasporangiaceae、norank_o_Acidobacteriales、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_c_AD3等菌群均與酚酸類物質(zhì)的含量呈不同程度的相關(guān)性。以上結(jié)果表明，烤煙根際土壤中酚酸類化合物含量與土壤細(xì)菌群落分布有顯著的相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

酚酸類物質(zhì)作為單一連作體系中重要的化感物質(zhì)近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注，業(yè)已證明，酚酸類物質(zhì)在地黃[21]、草莓[22]和三七[23]等的連作土壤中的含量數(shù)倍于輪作，且其在植煙土壤中同樣表現(xiàn)出富集效應(yīng)，隨連作年限增加積累過(guò)程明顯，酚酸類物質(zhì)的積累與作物連作障礙的發(fā)生關(guān)系密切。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)施入不同有機(jī)肥提供多樣化的碳源，能促進(jìn)土壤微生物多樣化生長(zhǎng)，從而能減輕連作病害及自毒作用[24-25]。本研究亦發(fā)現(xiàn)植煙土壤進(jìn)行有機(jī)肥補(bǔ)充能在一定程度上降低烤煙根際土壤中酚酸物質(zhì)的含量，2種生物有機(jī)肥處理植煙土壤中對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、4-香豆酸的含量均較常規(guī)單施煙草專用復(fù)合肥有不同程度的減少，且不同施肥處理后烤煙根際土壤中酚酸物質(zhì)的總量表現(xiàn)為煙草專用復(fù)合肥+生物有機(jī)肥<單施煙草專用復(fù)合肥，增施生物有機(jī)肥后酚酸物質(zhì)總量降低達(dá)10%以上，說(shuō)明，生物有機(jī)肥對(duì)緩解煙草的化感自毒也有一定的作用。這與前人常規(guī)復(fù)合肥+有機(jī)肥較單施常規(guī)復(fù)合肥更有利于減輕煙草土壤的自毒作用的研究結(jié)論[26]相一致。

眾多學(xué)者研究表明，生物有機(jī)肥中含有大量的有機(jī)質(zhì)及微生物活體，能夠優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物的功能多樣性[27-28]。本研究結(jié)論與之一致，植煙土壤中增施生物有機(jī)肥明顯提升了烤煙根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)，與常規(guī)單施煙草專用復(fù)合肥相比，生物有機(jī)肥T1、T2處理的OTU豐度分別增加了8.06%和14.48%、Shannon指數(shù)分別增加了0.49%和2.95%、ACE指數(shù)分別增加了5.21%和16.50%、Chao1指數(shù)分別增加了4.46%和15.23%。此外，不同施肥處理烤煙根際土壤細(xì)菌群落存在明顯差異，2種生物有機(jī)肥處理的變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度較常規(guī)單施煙草專用復(fù)合肥均有明顯提升，而綠彎菌門（Chloroflexi）、WPS-2和破壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度卻有不同程度的降低;同時(shí)，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等有益微生物的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為有機(jī)肥處理高于常規(guī)單施煙草專用復(fù)合肥處理。總體看來(lái)，施用生物有機(jī)肥有利于提升植煙土壤中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度，促進(jìn)有益土壤微生物的生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)可通過(guò)直接的自毒作用或間接地抑制或促進(jìn)土壤微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而顯著地影響土壤中微生物的生物量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)[29-30]。環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析表明，烤煙根際土壤中酚酸類自毒物質(zhì)的含量與土壤細(xì)菌群落的分布有顯著的相關(guān)性，其中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）與對(duì)羥基苯甲酸、酚酸物質(zhì)總量以及4-香豆酸均呈顯著負(fù)相關(guān);芽孢桿菌屬（Bacillus）與阿魏酸、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）與丁香酸和4-香豆酸亦呈顯著負(fù)相關(guān);與此相反，熱酸菌屬（Acidothermus）與對(duì)羥基苯甲酸、酚酸物質(zhì)總量呈顯著正相關(guān)。由此可見(jiàn)，本研究中增施生物有機(jī)肥后植煙土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等有益微生物的相對(duì)豐度增加可能與其根際土壤中對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、4-香豆酸的含量以及酚酸物質(zhì)總量降低密切相關(guān)，但各種酚酸類物質(zhì)與不同細(xì)菌群落的互作及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

根際微生態(tài)是作物-土壤-微生物及其環(huán)境相互作用的特殊系統(tǒng)，作物根系分泌物-土壤-微生物在它們構(gòu)成的土壤微生態(tài)系統(tǒng)中相互作用，共同影響著作物的生長(zhǎng)發(fā)育，協(xié)調(diào)好它們之間的關(guān)系是解決作物連作障礙的關(guān)鍵[2]。生物有機(jī)肥可通過(guò)物理、化學(xué)及生物過(guò)程參與形成土壤有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合體，形成穩(wěn)定團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)，改善土壤理化性狀[31]，促進(jìn)土壤微生物多樣性生長(zhǎng)，有利于協(xié)調(diào)作物根系分泌物、土壤、土壤微生物三者之間的關(guān)系，營(yíng)造健康的根際微生態(tài)環(huán)境，對(duì)緩解化感自毒引起的煙草連作障礙能起到一定的提質(zhì)增效作用。

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