基于UPLC-QTOF/MS的藍(lán)莓果實發(fā)育代謝組學(xué)差異分析

王倩 張長青 李廣平 李海玲 趙輝

摘要：藍(lán)莓做為深受消費者喜愛的一種新興高經(jīng)濟(jì)價值水果，果實風(fēng)味、色澤和果皮厚度等直接影響其商品品質(zhì)。為探究果實成熟期間各小分子物質(zhì)變化對果品品質(zhì)的影響，通過高效液相色譜及質(zhì)譜分析，從代謝組學(xué)水平對成熟果實中小分子化合物通路成分和變化進(jìn)行研究。以幼果為對照，共篩選出858個差異離子，其中414個為上調(diào)，444個為下調(diào)。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫通路注釋，鑒定出294種差異代謝物，可分為13大類，其中苯丙酯類和聚酶化合物數(shù)量最多，達(dá)61種，占總數(shù)的20.6%，其次是有機(jī)含氧化合物與脂類和類脂分子，各有48種，這些代謝物涵蓋了糖類、有機(jī)酸、氨基酸、脂類和胺類等化合物。該結(jié)果有助于揭示藍(lán)莓果實成熟的生理發(fā)育機(jī)制，可為高品質(zhì)藍(lán)莓的培育提供參考。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;代謝組學(xué);果實發(fā)育;通路分析

中圖分類號：S663.901 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0148-05

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）果樹，又名越橘。其果實為藍(lán)色漿果，具有白色果粉，味道酸甜并帶有芳香氣味。同時藍(lán)莓果實富含花青素、多酚等物質(zhì)，因而具有較強(qiáng)的抗氧化能力，深受消費者喜愛，是具有較高經(jīng)濟(jì)價值和廣闊前景的果樹樹種[1]。近些年我國科研單位陸續(xù)開展藍(lán)莓果樹的研究與利用，推動了我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。目前南方主栽品種主要為兔眼藍(lán)莓和南高叢藍(lán)莓，多數(shù)存在果實小、風(fēng)味淡、口感不佳等問題。華星等研究發(fā)現(xiàn)隨著藍(lán)莓果實發(fā)育，總酚和總黃酮等物質(zhì)含量呈先下降再升高的趨勢，同時己糖、葡萄糖和果糖的積累可以促進(jìn)花色苷的形成[2]。

代謝組學(xué)全譜分析是對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關(guān)系的研究技術(shù)，其研究對象是相對分子質(zhì)量小于1 000 u的小分子物質(zhì)，如脂類、酮類和有機(jī)酸等[3]。使用代謝組學(xué)分析樣本不僅能系統(tǒng)地分析主要差異物的影響，還能對一些常規(guī)分析方法難以檢測到的物質(zhì)進(jìn)行檢測，因此是開展生理差異分析的重要手段。代謝組分析可以從大量代謝物中篩選出具有統(tǒng)計學(xué)和生物學(xué)意義的差異代謝物，并以此為基礎(chǔ)闡明生物體的代謝過程和變化機(jī)制差異[4-5]。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，組學(xué)研究方法被應(yīng)用于果實發(fā)育與成熟的研究中，但藍(lán)莓中相關(guān)研究較少。由于藍(lán)莓的高營養(yǎng)價值，研究人員對其營養(yǎng)成分、抗氧化活性物質(zhì)等研究較為深入。但利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對藍(lán)莓果實發(fā)育過程中代謝物質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析，從差異代謝物及代謝途徑等方面進(jìn)行闡述的研究甚少。

為研究藍(lán)莓果實成熟期間各小分子物質(zhì)變化對果品品質(zhì)的影響，本研究通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，從代謝組學(xué)水平對成熟果實中小分子化合物組分差異和通路成分進(jìn)行分析，以期為藍(lán)莓果實發(fā)育代謝組學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計

以金陵科技學(xué)院園藝實驗站種植的兔眼藍(lán)莓（Vaccinium ashei）品種“粉藍(lán)”為試材，樹齡達(dá)10年以上，分別在果實膨大期（直徑5 mm）和成熟期采集果實樣本。對于每個樣品均等分成4份，每份100 g，用干冰儲藏運送進(jìn)行代謝物提取。

1.2 方法

1.2.1 代謝物提取 樣品采用有機(jī)試劑沉淀蛋白法進(jìn)行代謝物提取，具體過程如下：經(jīng)-80 ℃保存的果實樣品先放置于-20 ℃環(huán)境下30 min，再放置于4 ℃冰箱解凍。向每個樣品管中添加 800 μL 冷凍后的甲醇 ∶ 水（體積比為1 ∶ 1）緩和溶液。在每個樣品管中分別加入2個鋼珠，利用組織研磨器進(jìn)行充分研磨，設(shè)置參數(shù)為50 Hz，5 min;取出鋼珠，將離心管放置在-20 ℃冰箱中沉淀2 h，然后在4 ℃、30 000 g條件下離心15 min。分別從每個樣品中取出650 μL放入新樣品管中，并在 4 ℃、25 000 g條件下離心15 min，然后從每個樣品中取出550 μL放入新樣品管中，按照順序?qū)悠贩胖帽４?。最后，每個樣品取30 μL混合，制成質(zhì)量控制（QC）樣品，進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.2.2 代謝物分離 用質(zhì)控（QC）樣品平衡儀器后，采用超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters，UK）進(jìn)行色譜分離，色譜柱溫度保持在50 ℃，流速為 0.4 mL/min，其中流動相A為水和0.1%甲酸，流動相B為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物使用以下梯度洗脫：0～2 min，100%流動相A;2～11 min，0～100%流動相B;11～13 min，100%流動相B;13～15 min，0～100%流動相A。每個樣品的上樣體積為10 μL。

1.2.3 代謝物檢測 用高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀Xevo G2-XS QTOF （Waters，UK）對色譜柱上洗脫下來的小分子代謝物進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測。對于正離子模式，毛細(xì)管電壓和取樣錐電壓分別設(shè)置為3.0 kV和40.0 V;對于負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓和取樣錐電壓分別設(shè)置為2.0 kV和40.0 V。用質(zhì)心均方誤差模式進(jìn)行質(zhì)心數(shù)據(jù)采集。一級掃描范圍為50～1 200 u，掃描時間為0.2 s。用20～40 eV的能量對所有母離子進(jìn)行碎片化，掃描時間為0.2 s。在數(shù)據(jù)采集過程中，每3 s對亮氨酸腦啡肽信號進(jìn)行1次實時質(zhì)量校正。同時，每隔10個樣品進(jìn)行1次質(zhì)量控制樣品采集，用來評估樣品數(shù)據(jù)采集過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用軟件Progenesis QI （version 2.2）對質(zhì)譜下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊、峰提取和峰鑒定等[6-7]。單變量分析采用t檢驗和變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C analysis），多變量分析采用無監(jiān)督的主成分分析方法（principal component analysis，PCA）。采用單變量分析差異倍數(shù)（fold change）和q值來篩選差異表達(dá)的代謝物，以差異倍數(shù)≥1.2 或≤0.833 3，q-value 值小于0.05作為篩選差異代謝物的條件。使用R軟件中的pheatmap包中的pheatmap函數(shù)進(jìn)行聚類分析，并基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物代謝通路注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異代謝物檢測分析

通過變異倍數(shù)分析（FC）和火山圖（圖1），可直觀顯示出2組代謝物間變化的顯著性，從而篩選差異性代謝物。篩選條件為FC值小于等于0.833 3或大于等于1.2，且q-value值小于0.05。圖1為成熟果實和幼嫩果實組織間正離子模式下的火山圖，log2 （fold change）為橫坐標(biāo)，q-value的負(fù)對數(shù)-lg（q-value）為縱坐標(biāo)，紅點為篩選出的差異表達(dá)的代謝物。

代謝組學(xué)分析中，主成分分析（PCA）主要用于觀察實驗?zāi)Ｐ椭械慕M間分離趨勢，是否有異常點出現(xiàn)，以及反映組間和組內(nèi)變異度的分析技術(shù)。PCA分析結(jié)果（圖2）表明，2個處理的4次重復(fù)在得分圖中分布較為集中，表明每個處理內(nèi)差異較小，本次試驗的穩(wěn)定性比較好。紅色標(biāo)注為成熟果實4個樣本，藍(lán)色標(biāo)注為幼嫩果實4個樣本。橫坐標(biāo)為第一主成分PC1，由圖可知該主成分能綜合原始信息的比例為45.01%，縱坐標(biāo)為第二主成分PC2，該主成分能綜合原始信息的比例為20.2%。成熟果實和幼嫩果實2組間PCA得分差異顯著，相距較遠(yuǎn)，且處于95%置信區(qū)間內(nèi)，表明2個組分間的代謝產(chǎn)物存在較大的差異。

2.2 差異離子聚類分析

在正離子模式條件下，提取峰后共得到 1 784個差異離子，經(jīng)一級數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)庫后鑒定到1 150個差異離子，其中527個為上調(diào)，623個為下調(diào);經(jīng)數(shù)據(jù)庫理論二級碎片搜索后鑒定到858個差異離子，其中414個為上調(diào)，444個為下調(diào)。對篩選出來的離子進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。

2.3 差異代謝物通路分析

通過代謝通路分析能夠更好地了解代謝物所參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]，基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物代謝通路注釋，共鑒定出294種代謝物，可分為13大類，詳見圖4。苯丙酯類和聚酮化合物最多，達(dá)61種（占總差異物的20.6%），其次是有機(jī)含氧化合物與脂類和類脂分子相同，均為48種（各占總差異物的16.2%），苯環(huán)類化合物為44種（占總差異物的14.9%），有機(jī)雜環(huán)化合物為43種（占總差異物的14.5%），有機(jī)酸及其衍生物為37種（占總差異物的12.5%），涵蓋了糖類、有機(jī)酸、氨基酸、脂類和胺類等化合物。

這些差異代謝物參與了果實發(fā)育過程中不同的生物代謝途徑[9-10]，由圖5可見，共有40個差異代謝物參與了賴氨酸降解過程。其中L-2-氨基己二酸6-半醛、6-氨基-2-氧代己酸甲酯和5-氨基戊酸鹽作為生物素關(guān)鍵因素對L-賴氨酸降解發(fā)揮較大的促進(jìn)調(diào)控作用。6-乙酰氨基-2-氧代己酸甲酯起抑制作用，需氧菌素對于果實發(fā)育的調(diào)控作用尚不明確。

3 討論

賴氨酸在脫羧酶的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)可生成1，5-戊二胺（又稱為尸胺），有研究表明戊二胺可以作為第二信使調(diào)控植物衰老過程，并能促進(jìn)雌蕊和雄蕊的發(fā)育，外源添加戊二胺可以改善坐果和促進(jìn)果實發(fā)育。同時戊二胺也是生物合成喹嗪堿的前體，而喹嗪堿在調(diào)節(jié)植物新陳代謝和合成次級代謝產(chǎn)物方面也起著重要的作用。一般來說，隨著果實的成熟，胺類物質(zhì)積累量會逐漸減少[11]。本研究中關(guān)于藍(lán)莓胺類物質(zhì)的研究結(jié)果支持了這一觀點。在成熟果實中，多胺含量，包括Spd、Spm、4-氨基丁烷和tSpm等，均較幼果低。

代謝組學(xué)是通過分析海量代謝物信息，來探究生物體內(nèi)源性代謝物整體及其變化規(guī)律的科學(xué)。海量信息的獲取不僅受提取方法的影響，還受檢測儀器的分辨率等因素的影響。代謝組學(xué)常用高分辨檢測技術(shù)有 GC-MS 和LC-MS，與 LC-MS 相比，GC-MS 不宜進(jìn)行熱不穩(wěn)定代謝物的分析，且樣品前處理需衍生化，不僅操作繁瑣、耗時，還可能引入干擾物[12]，對組學(xué)分析產(chǎn)生誤差。LC-MS 技術(shù)雖較晚應(yīng)用到代謝組學(xué)中，但具有檢測范圍廣，適用于熱不穩(wěn)定代謝物，前處理簡單，基本不需要衍生化等優(yōu)點。本研究采用的 QTOF（飛行時間質(zhì)譜）技術(shù)，是目前使用較普遍的代謝組學(xué)質(zhì)譜分析儀器，準(zhǔn)確度能達(dá)到1×10-6 mg/L，通過與超高壓液相色譜聯(lián)用，掃描速度快，為代謝物的定性分析提供更多依據(jù)[13]。本試驗通過高效液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，揭示了在果實成熟中賴氨酸降解的代謝通路中各小分子化合物的作用，研究結(jié)果拓展了人們關(guān)于藍(lán)莓小分子代謝物的認(rèn)知和應(yīng)用。

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