月桂酸對(duì)青春期小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育的影響

王佳鑫，曹 宇，李 雯，葛玉松，付守鵬，柳巨雄

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130062)

乳腺是哺乳動(dòng)物哺育后代的唯一器官，乳腺的發(fā)育程度直接決定幼畜的生長(zhǎng)狀況[1]。乳腺發(fā)育經(jīng)歷了幾個(gè)不同的時(shí)期，包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期,其乳導(dǎo)管分支及終末端的形成主要發(fā)生于青春期[2]。而乳腺腺泡細(xì)胞的分化及泌乳的啟動(dòng)主要發(fā)生于妊娠期和泌乳期。因此，青春期乳腺的發(fā)育程度直接決定了泌乳期腺泡細(xì)胞的數(shù)量[3-4]。

乳腺組織的發(fā)育受到許多激素和生長(zhǎng)因子的調(diào)控，此外，乳腺發(fā)育也受到脂肪酸的影響[5-6]。據(jù)報(bào)道，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖減少，乳腺發(fā)育受阻[7]。添加油酸可促進(jìn)青春期小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育[8]。由此可見(jiàn)脂肪酸在乳腺發(fā)育中起重要作用。月桂酸主要存在于椰子油(45%～52%)和棕籽油(44%～52%)中。已有報(bào)道，月桂酸有良好的抗菌作用且有利于燒傷組織的再生，并可預(yù)防由睪酮引起的大鼠前列腺增生[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加月桂酸可影響大鼠乳汁中脂肪酸的分泌，哺乳期母鼠飼糧中添加月桂酸可增加子代小鼠平均體質(zhì)量[11-12]。因此我們推測(cè)，月桂酸可能通過(guò)影響乳腺發(fā)育從而改變泌乳。本研究通過(guò)體外向mMECs中添加月桂酸和體內(nèi)飼喂月桂酸的方式，研究月桂酸對(duì)青春期小鼠乳腺發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理將mMECs在含有10%FBS的DMEM中于5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng),然后添加不同濃度的月桂酸(0，50，100，150，200 μmol/L)培養(yǎng)1 d。

1.2 CCK-8法將mMECs與月桂酸孵育2 d后，使用CCK8試劑盒檢測(cè)mMECs的增殖。 將mMECs在37℃下與每個(gè)孔中的10 μL CCK8孵育1 h后，用450 nm酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。

1.3 免疫印跡分析使用RIPA裂解緩沖液分離出mMECs和小鼠乳腺的總蛋白，用PierceTMBCA蛋白測(cè)定試劑盒確定蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4℃下孵育過(guò)夜，然后用HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠(1∶3 000)或山羊抗兔(1∶3 000)二抗在室溫下孵育1 h ，用ECL Plus超敏發(fā)光溶液可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.4 流式細(xì)胞儀分析將mMECs用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，在4℃下用1 mL預(yù)冷的70%酒精固定12 h，離心3～5 min，除去上清液，保留約50 μL 70%乙醇。加入1 mL預(yù)冷的PBS并將細(xì)胞重懸，離心細(xì)胞，小心除去上清液并保留50 μL PBS。 輕彈管的底部以分散細(xì)胞， 向每個(gè)樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色溶液，將細(xì)胞緩慢完全懸浮，并在黑暗中于37℃保持30 min。使用流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessaTM)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5 全組織染色分析通過(guò)頸脫位法處死小鼠，打開(kāi)皮膚，暴露乳腺，摘取乳腺并鋪在經(jīng)4%多聚賴(lài)氨酸處理的載玻片上，卡諾氏液固定過(guò)夜。將乳腺浸入70%,35%和15%的乙醇中10 min，室溫下用胭脂紅明礬(2 g / L)染色過(guò)夜。染色后將載玻片在酒精中漂洗10 min，浸入二甲苯中使用立體顯微鏡觀察。

1.6 動(dòng)物和體內(nèi)試驗(yàn)所有動(dòng)物試驗(yàn)和護(hù)理程序均按照吉林大學(xué)動(dòng)物保護(hù)福利規(guī)程進(jìn)行。將出生4周的小鼠分為對(duì)照組(喂食對(duì)照飲食，n=6)和月桂酸組(飲用水含0.05%,0.10%和1.00%的月桂酸，n=6)，4周后處死小鼠并收集第4對(duì)乳腺。將左乳腺冷凍在-80℃用于進(jìn)一步分析，右乳腺用于組織染色。

1.7 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。 使用t檢驗(yàn)和單因素方差分析確定均值之間的差異，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 月桂酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響CCK8法檢測(cè)不同濃度月桂酸對(duì)mMECs增殖率的影響，結(jié)果表明100 μmol/L月桂酸能顯著增加mMECs的增殖率，而50,150和200 μmol/L月桂酸對(duì)mMECs增殖沒(méi)有顯著性影響(圖1)。

圖1 不同濃度月桂酸對(duì)mMECs增殖的影響

2.2 月桂酸對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響Western blot法檢測(cè)不同濃度月桂酸對(duì)mMECs中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響，結(jié)果表明，100 μmol/L月桂酸能顯著增加mMECs中Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表達(dá)量(圖2)。

圖2 不同濃度月桂酸對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響

2.3 月桂酸對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)月桂酸對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明，100 μmol/L月桂酸可顯著增加S期細(xì)胞，并顯著減少G1/G0期細(xì)胞(圖3)。

圖3 100 μmol/L月桂酸對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.4 月桂酸通過(guò)ERK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)有研究表明，ERK1/2信號(hào)通路在細(xì)胞增殖過(guò)程中具有重要作用。因此，我們使用ERK1/2的抑制劑U0126探討ERK1/2信號(hào)通路在月桂酸促進(jìn)mMECs增殖標(biāo)志物中的作用。結(jié)果表明，月桂酸能顯著增加了p-Rb/Rb的比值 (圖4A,E)，而U0126可完全阻斷月桂酸促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的作用(圖4A,C,D)，并阻斷增加p-Rb/Rb比值的作用 (圖4A,E)。

2.5 乳導(dǎo)管及終末端的檢測(cè)通過(guò)胭脂紅染色法檢測(cè)了含有不同濃度月桂酸的飲用水(0.00%,0.05%,0.10%和1.00%)對(duì)青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量的影響,結(jié)果表明，飲用水中包含0.05%月桂酸能顯著增加青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量(圖5)。

2.6 飼喂月桂酸對(duì)青春期小鼠乳腺中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響Western blot法檢測(cè)了乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表達(dá)量,結(jié)果表明，0.05%月桂酸顯著增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表達(dá)量(圖6)。

圖4 U0126對(duì)月桂酸促進(jìn)mMECs中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響 A.Western blot;B.Cyclin D1;C.Cyclin D3;D.PCNA;E.pRb/Rb

圖5 不同濃度月桂酸對(duì)青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量的影響 A.對(duì)照組;B.0.05%月桂酸組；C.0.10%月桂酸組；D.1.00%月桂酸組

圖6 月桂酸對(duì)青春期小鼠乳腺中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L的月桂酸通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而增加了Rb蛋白的磷酸化水平促進(jìn)mMECs增殖。此外，飲用水中含0.05%的月桂酸也顯著增加了青春期小鼠乳腺中乳導(dǎo)管分支及終末端的形成，并顯著增加了Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表達(dá)。

乳腺的主要作用是分泌乳汁從而為新生兒提供營(yíng)養(yǎng)[13]。乳腺上皮細(xì)胞是乳導(dǎo)管的重要組成部分，一般來(lái)說(shuō)，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量決定了泌乳量。因此，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖可增加泌乳量[14]。乳腺上皮細(xì)胞增殖受激素水平、營(yíng)養(yǎng)條件等多種因素影響。已有研究表明，長(zhǎng)鏈脂肪酸中油酸、n-3多不飽和脂肪酸等可促進(jìn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育[8,15]，而硬脂酸則抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖[16]。月桂酸是一種12碳的中鏈脂肪酸，我們研究發(fā)現(xiàn)，月桂酸可顯著促進(jìn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳導(dǎo)管的發(fā)育。

細(xì)胞增殖標(biāo)志物(Cyclin D1/D3和PCNA)在調(diào)控細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。研究表明，Cyclin D1通過(guò)結(jié)合并激活CDK4/6從而與Rb蛋白結(jié)合[17]，進(jìn)而促進(jìn)Rb-E2F1復(fù)合物解離，從而推動(dòng)細(xì)胞由G1期到S期過(guò)渡[18-19]。此外，Cyclin D1的高表達(dá)也與乳腺癌的發(fā)生具有密切的關(guān)聯(lián)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1也可與PCNA結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA合成，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[21]。PCNA是一種在DNA復(fù)制和損傷修復(fù)中起重要作用的核蛋白，其在S期的表達(dá)明顯增加[22]。作為DNA聚合酶的輔助蛋白，PCNA鏈接著DNA聚合酶在DNA鏈上滑動(dòng)，為聚合酶的持續(xù)工作發(fā)揮作用[23]。Cyclin D3與Cyclin D1的作用相似，可以促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換，還可以維持終末分化，在已分化組織的靜止細(xì)胞中普遍高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖中起關(guān)鍵作用[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)，添加高表達(dá)Cyclin D3可以有效促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，當(dāng)誘導(dǎo)HL-60白血病細(xì)胞分化時(shí)，Cyclin D3的表達(dá)明顯增高[25]。在本研究中，100 μmol/L的月桂酸顯著增加了mMECs中Cyclin D1/D3和PCNA蛋白的表達(dá)量。此外，在體內(nèi)試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，月桂酸不僅促進(jìn)了乳導(dǎo)管分支及終末端的形成，也增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1/D3和PCNA的表達(dá)量。這表明月桂酸可能通過(guò)增加Cyclin D1/D3和PCNA的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)mMECs的增殖。

為了研究月桂酸如何通過(guò)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)促進(jìn)mMECs增殖，我們隨后檢測(cè)了與增殖相關(guān)的ERK1/2信號(hào)通路。此前的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號(hào)通路的激活可以顯著促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化及遷移[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸可通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)BMECs增殖[27]。本研究在添加ERK1/2抑制劑后發(fā)現(xiàn)，月桂酸通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路增加Cyclin D1/D3和PCNA的蛋白表達(dá)。此外，月桂酸還增加了p-Rb/Rb的比值，而ERK1/2抑制劑消除了這種作用。這表明月桂酸可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)促進(jìn)mMECs的增殖。

本研究結(jié)果表明，月桂酸通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)青春期小鼠乳腺的發(fā)育。