運輸應激對山羊免疫器官的病理損傷及熱休克蛋白表達的影響

鄭文亞，彭瑞妮，劉 犇，張雯苑，梅 婷，章志濤，李國生，鄒劍偉，崔 燕

(1.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，甘肅 蘭州 730070；3.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西 宜春 336000)

隨著我國山羊養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，在山羊養(yǎng)殖過程中，由于引種、異地采購、異地繁育等需要，遠距離運輸難以避免。目前主要以車輛運輸為主，長途運輸過程中，顛簸、震動、噪音、高(低)溫和禁食禁水等刺激因素往往導致山羊發(fā)生心跳呼吸頻率加快、驚恐或狂躁不安等應激反應。當應激強度超過機體的自我調(diào)節(jié)能力時，其免疫系統(tǒng)受到嚴重損害，體質(zhì)條件差的山羊甚至會發(fā)生死亡，由運輸應激引起的疾病和死亡對山羊養(yǎng)殖帶來的危害及經(jīng)濟損失不容小覷。熱休克蛋白(HSPs)是細胞在應激原誘導下生成的一組蛋白質(zhì)，與運輸應激關系緊密，其中HSP27、HSP70和HSP90是研究較多的應激誘導型熱休克蛋白[1-2]。目前，國內(nèi)外關于應激對動物熱休克蛋白影響的報道，主要以鼠[3]、雞[4]和豬[5]等為研究對象，對山羊等反芻動物的研究較少。有研究表明，熱休克蛋白可以與一些抗原遞呈細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞等上的某些Toll樣受體(TLR)結合來激活非特異性免疫系統(tǒng)，此外，特異性免疫系統(tǒng)也可以借助這種方式被激活[6]。因此，熱休克蛋白能通過上述途徑來介導免疫反應。免疫反應與免疫器官的結構和功能密不可分，本試驗就運輸應激對山羊免疫器官的病理損傷以及熱休克蛋白表達的影響進行研究，為減少山羊運輸損傷和探明抗運輸應激機制等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計將12只飼養(yǎng)條件相同，體質(zhì)量相近(13.89±2.96) kg的健康公山羊隨機分為3組，對照組、運輸應激2 h組和6 h組。對照組在原來環(huán)境下正常飼養(yǎng)，其余2組分別進行2 h和6 h的運輸(車速35～45 km/h)，車內(nèi)溫度28～32℃，途中禁食禁水，運輸后立即剖殺，采集腸系膜淋巴結和脾臟，分別放入4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液和液氮中，用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗材料小鼠SP試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉生物工程公司；HSP27、HSP70、HSP90等一抗和二抗Goat Anti-Mouse IgG購自Abcam公司；Mouse Anti-β-actin、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自博士德生物；總蛋白提取試劑盒和蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)購自普利萊基因技術公司；4×Protein SDS PAGE Loading Buffer購自北京寶日醫(yī)生物技術公司；超敏化學發(fā)光檢測試劑盒購自US Everbright Inc公司。

1.3 顯微和超微結構觀察將4%多聚甲醛固定的淋巴結和脾臟組織在流水中沖洗過夜，取出后經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟，制成5 μm厚的連續(xù)切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察并拍照；將2.5% 戊二醛固定的淋巴結和脾臟組織，經(jīng)1%鋨酸固定，脫水、包埋和超薄切片機切片后，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察并拍照。

1.4 免疫組織化學染色切片脫蠟至水，在檸檬酸緩沖液中進行微波抗原修復，按照小鼠SP試劑盒說明操作。一抗均按照1∶400稀釋后使用，DAB顯色后用蘇木精復染。經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕色為強表達，黃色為中等表達，淡黃色為弱表達，不著色為不表達。

1.5 Western blot測淋巴結和脾臟樣品質(zhì)量后用總蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，用BCA法測定蛋白濃度并將正常組和運輸組的蛋白濃度調(diào)為一致，按1∶3的比例加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，95℃變性10min后上樣。電泳2.5 h后進行轉(zhuǎn)膜，用PVDF膜濕轉(zhuǎn)1 h，電轉(zhuǎn)后取出PVDF膜用TBST漂洗后封閉2 h，再用TBST漂洗3次，10 min/次，放入一抗(HSP27 1∶5 000，HSP70 1∶1 000，HSP90 1∶1 000，內(nèi)參蛋白Mouse Anti-β-actin 1∶1 000)在垂直混合儀中4℃孵育18 h；取出后用TBST漂洗3次，10 min/次，接下來放入二抗(一抗為HSP27、HSP70、HSP90和內(nèi)參蛋白對應的二抗?jié)舛确謩e為1∶8 000，1∶20 000，1∶2 000，1∶10 000)在水平搖床上孵育2 h后用TBST漂洗3次，10 min/次，最后用超敏化學發(fā)光檢測試劑盒在暗環(huán)境下顯色并在Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀上拍照。

1.6 圖像采集與統(tǒng)計分析將圖片用Image Pro Plus 6.0軟件讀取目的條帶密度值后，與內(nèi)參蛋白密度值進行比較，記為測試值。再用SPSS 18.0軟件進行分析，結果記為平均值±標準差，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 淋巴結和脾臟的病理學觀察

2.1.1淋巴結 光鏡觀察顯示，與對照組相比，運輸2 h組皮質(zhì)的淋巴小結體積增大，數(shù)量增多，生發(fā)中心明顯；髓質(zhì)的髓索變粗，髓竇中充滿淡紅色紅染物質(zhì)，且伴有巨噬細胞增生。運輸6 h時，淋巴小結增生愈發(fā)明顯，但生發(fā)中心的淋巴細胞核可見核碎片，淋巴細胞數(shù)量有所下降，髓質(zhì)中髓索和髓竇的界限不清(圖1)。電鏡觀察顯示，運輸6 h組淋巴結的淋巴細胞線粒體腫脹，出現(xiàn)空洞；部分淋巴細胞核膜破裂，染色質(zhì)呈碎塊狀，細胞器結構不清；少數(shù)淋巴細胞胞核呈鋸齒狀或核膜凹陷；偶見淋巴細胞核中出現(xiàn)包涵體，網(wǎng)狀細胞線粒體腫脹變空，形態(tài)異常，呈細長型；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒(圖2)。

圖1 山羊淋巴結的顯微結構觀察 A～C.對照組;D～F.運輸應激2 h組;G～I.運輸應激6 h組。C.被膜;LN.淋巴小結;MC.髓索;MS.髓竇;圓框.淡紅色滲出物;箭頭(黑).巨噬細胞

圖2 山羊淋巴結的超微結構觀察 A～F.運輸應激6 h組淋巴結超微結構電鏡觀察不同視野圖。L.淋巴細胞;ret.網(wǎng)狀細胞;M.線粒體;RER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);箭頭(黑).核膜凹陷;圓框.包涵體

2.1.2脾臟 光鏡觀察顯示，與對照組相比，運輸2 h 組脾小結增生，邊緣區(qū)面積明顯增寬，紅髓中可見大量紅細胞，且有含鐵血黃素顆粒散在分布。運輸6 h時，紅髓中的紅細胞數(shù)量有所減少，脾小結淋巴細胞可見核碎片，且數(shù)量有所減少，細胞間空隙變寬(圖3)。電鏡觀察顯示，脾臟的淋巴細胞線粒體腫脹變空，嵴斷裂或減少；部分淋巴細胞高爾基體擴張，扁平囊膜出現(xiàn)空泡，偶見淋巴細胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體。淋巴細胞間可見凋亡細胞，固縮，電子密度高，核質(zhì)比增大，核周間隙增寬，可見凋亡小體。髓質(zhì)中出現(xiàn)較多中性粒細胞，其表面短小微絨毛消失，表面光滑，染色質(zhì)固縮，核膜破裂，小梁內(nèi)平滑肌細胞線粒體腫脹變空，呈細長形。網(wǎng)狀細胞線粒體腫脹，內(nèi)腔基質(zhì)中出現(xiàn)界限不清的絮狀物質(zhì)。漿細胞核周間隙變寬，內(nèi)部清亮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，局部擴張，似篩狀結構(圖4)。

圖3 山羊脾臟的顯微結構觀察 A～B.對照組;C～D.運輸2 h組;E～F.運輸6 h組。RP.紅髓;SN.脾小結;黑箭頭.含鐵血黃素顆粒

圖4 山羊脾臟的超微結構觀察 A～F.運輸應激6 h組脾臟超微結構電鏡觀察不同視野圖。L.淋巴細胞；RBC.紅細胞；NG.中性粒細胞；SMC.平滑肌細胞；ret.網(wǎng)狀細胞；P.漿細胞；M.線粒體；RER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；圓形框.核內(nèi)包涵體；黑箭頭.核周隙增寬；白箭頭.核膜破裂；正方形框.小梭形的特殊顆粒；長方形框.圓形的嗜天青顆粒；橢圓框.密體；三角形框.絮狀物質(zhì)

2.2 熱休克蛋白在淋巴結和脾臟的表達

2.2.1淋巴結 免疫組織化學結果顯示，HSP27在對照組和運輸應激組的表達部位沒有明顯差異，在被膜和小梁以及血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈黃色，網(wǎng)狀細胞和髓竇竇壁內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈黃色，淋巴小結有散在的淋巴細胞胞核呈棕色，淋巴小結周圍彌散淋巴組織有部分淋巴細胞胞核呈棕色。HSP70在被膜和小梁以及血管內(nèi)皮細胞不著色，網(wǎng)狀細胞和髓竇竇壁內(nèi)皮細胞呈淡黃色。對照組和運輸應激2 h組在淋巴小結和髓索的淋巴細胞胞質(zhì)呈黃色，運輸6 h后淋巴細胞胞質(zhì)呈淡黃色。HSP90在對照組淋巴小結和髓索中的淋巴細胞胞核和胞質(zhì)呈淡黃色，運輸處理2h后，淋巴細胞胞核和胞質(zhì)呈黃色，運輸持續(xù)6 h時呈棕色(圖5)。

2.2.2脾臟 免疫組織化學結果顯示，HSP27在脾臟的被膜、小梁以及血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈黃色，對照組脾小結和邊緣區(qū)有散在淋巴細胞胞核呈棕色，外套區(qū)淋巴細胞胞核呈棕色，紅髓部分淋巴細胞胞核呈黃色，運輸2 h組紅髓淋巴細胞表達明顯，大部分淋巴細胞胞核呈棕色，運輸6 h組HSP27的表達情況與對照組類似。HSP70在脾臟的被膜、小梁以及血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)不著色，對照組在脾小結的淋巴細胞胞質(zhì)呈黃色，外套區(qū)幾乎不著色，邊緣區(qū)有散在的淋巴細胞胞質(zhì)呈棕色，運輸處理2 h，脾小結陽性表達淋巴細胞減少，只有散在的淋巴細胞胞質(zhì)呈淡黃色，運輸6 h組與2 h組的HSP70表達情況相似。HSP90在脾臟的被膜、小梁及血管內(nèi)皮細胞不表達，對照組脾小結和邊緣區(qū)淋巴細胞胞質(zhì)呈淡黃色，有少數(shù)在胞核呈淡黃色，外套區(qū)幾乎不著色，運輸2 h組和6 h組脾小結外套區(qū)淋巴細胞出現(xiàn)表達，胞核呈黃色，且與對照組相比，脾小結陽性表達淋巴細胞數(shù)量增多(圖6)。

2.3 熱休克蛋白在淋巴結和脾臟的定量表達

2.3.1淋巴結 Western blot結果顯示，山羊淋巴結HSP27蛋白表達量在對照組、運輸2 h和6 h組間無顯著性差異(P>0.05)。運輸2 h組HSP70蛋白表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05)，而運輸6 h 組HSP70蛋白表達量與2 h組相比下降，與對照組和2 h組均無顯著性差異(P>0.05)。運輸2 h和6 h組HSP90蛋白表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，而2 h和6 h組間HSP90蛋白表達量無明顯差異(P>0.05)。

圖5 HSP27、HSP70和HSP90在山羊淋巴結內(nèi)表達 A～C.HSP27表達情況；D～F.HSP70表達情況；G～I.HSP90表達情況。A，D，G.對照組；B，E，H.運輸2 h組；C，F(xiàn)，I.運輸6 h組。LN.淋巴小結；NC.小結帽

圖6 HSP27、HSP70和HSP90在山羊脾臟內(nèi)的表達 A～C.HSP27表達情況；D～F.HSP70表達情況；G～I.HSP90表達情況。A，D，G.對照組；B，E，H.運輸2 h組；C，F(xiàn)，I.運輸6 h組。SN.脾小結；黑箭頭.外套區(qū)

圖7 運輸應激2 h組、6 h組與對照組山羊淋巴結HSP27、HSP70和HSP90的相對表達量 同一蛋白3個組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3.2脾臟 Western blot結果顯示，運輸2 h組山羊脾臟HSP27蛋白表達量與對照組相比明顯升高(P<0.05)，運輸6 h組HSP27蛋白表達量比運輸2 h組下降，但與對照組和運輸2 h組間無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，運輸2 h組HSP70蛋白表達量下降，但無顯著差異(P>0.05)，但運輸6 h組HSP70蛋白表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，與2 h組之間無顯著性差異(P>0.05)。運輸2 h 和6 h組HSP90蛋白表達量均極顯著高于對照組(P<0.01)，而2 h和6 h組之間HSP90蛋白表達量無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

運輸是動物生產(chǎn)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，運輸質(zhì)量的好壞不僅關乎動物經(jīng)濟價值，還是有關動物福利的一個重要因素。有研究表明，盡量減少運輸時間，可以減少動物應激損傷從而保障動物福利[7]。運輸時間的延長，對動物而言雖初期裝載和運輸環(huán)境的心理壓力有所緩解，但疲勞、代謝損害和脫水等對它們的健康造成進一步的負面影響[8]。DE LA FUENTE等[9]對羔羊研究發(fā)現(xiàn)，運輸30 min的羔羊血液中皮質(zhì)醇和乳酸脫氫酶的濃度明顯高于運輸5 h，提示運輸應激導致機體損傷在運輸前期比較明顯，隨著運輸時間的延長，損傷可能得到緩解。同時也暗示不同運輸時間對動物機體造成的應激性損傷有所不同。

圖8 運輸應激2 h組、6 h組與對照組山羊脾臟HSP27、HSP70和HSP90的相對表達量 同一蛋白3個組間不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)，運輸2 h時，山羊的淋巴結和脾臟中的淋巴小結及脾小結增生明顯，運輸時間持續(xù)到6 h時，淋巴小結和脾小結的淋巴細胞都有核碎片，淋巴細胞線粒體腫脹呈空泡化，核膜凹陷，核內(nèi)出現(xiàn)包涵體，網(wǎng)狀細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，脾臟中的中性粒細胞微絨毛消失，核膜出現(xiàn)破裂。以上淋巴結和脾臟的病理變化，與山羊的免疫功能密切相關。淋巴結和脾臟是機體重要的外周免疫器官，是淋巴細胞聚集和生成的場所，2 h的運輸刺激尚未超過機體的自我調(diào)節(jié)能力，能使山羊免疫器官動員起來，代償性增生免疫細胞，提高免疫機能，以應對不良應激。張彩霞等[10]通過稀釋運輸2 h后的豬血清，發(fā)現(xiàn)能夠促進正常豬的外周淋巴細胞的增殖，也驗證了這一觀點。然而機體的代償是有一定限度的，超過其承受能力，極易誘導不完全代償甚至是失代償?shù)那闆r發(fā)生。在對山羊長途運輸12 h后，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素誘導淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞減少，導致機體免疫受到抑制[11]；小鼠處于冷應激時，前期機體處于積極抵抗狀態(tài)，后期機體的抵抗力是消極的[12]。結合本試驗結果說明，淋巴細胞的增殖在運輸條件下具有時效性[13]，隨著運輸時間的增加，代償能力受損，機體開始出現(xiàn)免疫抑制。

熱休克蛋白(HSPs)是Ritossa在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，自此引起了國內(nèi)外學者的廣泛關注。其作為一種天然的生理工具，無論是它們在新生蛋白中的伴侶功能還是細胞應激后的治療作用都引起了研究者們極大的興趣[14]。按照相對分子質(zhì)量的大小，熱休克蛋白可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白sHSP五個家族。其中報道較多的是HSP90、誘導型HSP70(也稱為HSP72)和小熱休克蛋白HSP27[15]。這3種蛋白與關鍵的凋亡因子有關，是功能強大的抗凋亡蛋白，能不同程度地阻斷細胞死亡[16]，是增強各種信號蛋白如CDK4、細胞周期激酶、類固醇激素受體和免疫防御反應的主要因素。HSP90占細胞總量的1%～2%，經(jīng)誘導后從基線水平增加到4%～6%[16-17]；HSP70作為分子伴侶蛋白，通過分子間的相互作用保護已合成的蛋白質(zhì)免受進一步的損傷，且能夠區(qū)分是應該修復細胞損傷并抑制細胞凋亡，還是在細胞損傷無法治療時允許凋亡發(fā)生[18-19]；HSP27具有較強的細胞保護作用，主要是由于它能在不同階段阻斷細胞凋亡[2]。這3種蛋白在機體受到外來應激時各司其職，協(xié)同作用，以促進機體的免疫調(diào)節(jié)。運輸應激時，山羊免疫組織細胞中的熱休克蛋白含量也會發(fā)生變化，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，協(xié)助組織細胞耐過逆境。有研究表明，免疫器官能感知熱休克蛋白表達水平的改變，比如香芹酚等就可能通過促進熱休克蛋白的生成來支持免疫調(diào)節(jié)[20]。FAN等[21]證實，腸外補充谷氨酰胺(GLN)聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)，可上調(diào)HSP90的表達，減輕淋巴器官和循環(huán)淋巴細胞的凋亡，增強免疫力，提高燒傷大鼠的成活率。對患膿毒癥動物添加脫氫表雄酮時，可以上調(diào)肺部和脾臟HSP70的表達量，從而增強細胞免疫；對雞的硒缺乏癥研究發(fā)現(xiàn)，在雞的脾臟和胸腺中HSP70和HSP90明顯上升，進而改善免疫狀態(tài)[22-23]。此外，HSP27、HSP70和HSP90在雞的免疫器官中顯著升高，并在氧化應激條件下表現(xiàn)出保護作用[24]。本研究結果顯示，對山羊運輸應激處理后，HSP90在淋巴結和脾臟中表達量顯著升高，而HSP70和HSP27在運輸6 h后，相比運輸2 h分別在淋巴結和脾臟中出現(xiàn)表達下降的趨勢，并且免疫組織也開始出現(xiàn)一些不可逆性的損傷。這可能與淋巴小結、脾小結中HSP70和彌散淋巴組織中HSP27的表達下調(diào)有一定的相關性，而HSP90的上調(diào)可能是為了緩解免疫組織的壓力。HSP70在脾臟中的下調(diào)可能由于應激時其儲備量被用來緩解壓力，消耗與合成還未形成正比。運輸應激2 h時，脾小結大量增生與HSP70的保護作用是分不開的。運輸應激6 h時，脾臟中淋巴細胞數(shù)量減少，雖然HSP90上調(diào)發(fā)揮保護作用，但隨著運輸時間的延長，應激對機體的損害進一步累加，HSP70的消耗量也大大增加，在這種失衡條件下，機體形成不可逆的病理損傷。總之，運輸應激可導致山羊免疫器官的組織損傷以及3種熱休克蛋白表達水平的變化。