腸道菌群在應(yīng)激誘發(fā)大鼠高血壓中的作用

吳芹 許子洋 劉麗萍 張文英 宋思遠(yuǎn)

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，鹽城 224005）

高血壓是最常見(jiàn)的慢性病之一，也是心、腦、腎疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》概要報(bào)道，我國(guó)現(xiàn)有2.45億高血壓患者［1］。當(dāng)今社會(huì)節(jié)奏快，競(jìng)爭(zhēng)壓力大，長(zhǎng)期過(guò)度的腦力工作負(fù)荷、持續(xù)緊張、長(zhǎng)期情緒或精神刺激、煩惱、焦慮等心理應(yīng)激，使高血壓及其并發(fā)癥心、腦、腎等疾病的發(fā)病率持續(xù)上升，嚴(yán)重威脅人群健康，并且造成巨大的社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。這些與現(xiàn)代生活方式相關(guān)的慢性應(yīng)激，正在成為新的心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素［2］。如果這些應(yīng)激因素持續(xù)存在，可能引起長(zhǎng)期的高血壓，通常稱為應(yīng)激性高血壓（Stressinduced hypertension，SIH）［3-4］。近來(lái)的研究顯示，高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關(guān)［5-6］，菌群對(duì)宿主血壓有直接影響［7］。無(wú)菌鼠的血壓相對(duì)降低［8］。用16S rRNA檢測(cè)高血壓大鼠和高血壓患者糞便的結(jié)果顯示，腸道菌群豐度和多樣性顯著下降，厚壁菌門（Firmicutes，F(xiàn)）/擬桿菌門（Bacteroidetes，B）的比率增加，標(biāo)志腸道菌群紊亂［9］。但慢性應(yīng)激引起的應(yīng)激性高血壓是否與腸道菌群的變化相關(guān)尚不清楚。本研究觀察應(yīng)激情況下，腸道菌群的變化以及通過(guò)四聯(lián)抗生素制備偽無(wú)菌鼠，研究腸道菌群的變化與應(yīng)激性高血壓發(fā)生的相關(guān)性，為預(yù)防應(yīng)激性高血壓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只200-250 g雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）-2018-0004］。大鼠進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)并稱重，分籠飼養(yǎng)?？刂骑暳稀嬎?、室溫等條件均相同。保持12 h光照/12 h黑暗日周期，自由采食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意，并嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器和試劑 應(yīng)激性高血壓造模系統(tǒng)（上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠），Illumina公司的Miseq PE300測(cè)序平臺(tái)（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司）；氨芐西林、萬(wàn)古霉素、新霉素、甲硝唑購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，去甲腎上腺素（NE）的ELISA試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)激性高血壓大鼠模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，使用計(jì)算機(jī)控制的足底電擊結(jié)合噪聲的刺激方法，制備應(yīng)激性高血壓大鼠模型。電擊和噪聲的間隔時(shí)間與組合均隨機(jī)。電擊籠的尺寸為22×22×26 cm3，底部鋪有銅柵，銅柵上可以通間斷性交流電。模型制備時(shí)，電擊電壓為35-80 V，同時(shí)隨機(jī)由蜂鳴器發(fā)出強(qiáng)度為90-100 db的噪聲，每次持續(xù)50 ms。應(yīng)激性高血壓大鼠（stress組）每天上、下午各接受1次（每日2次）應(yīng)激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，共14 d。對(duì)照組大鼠（sham組）飼養(yǎng)條件同stress組，并且每天2次，每次2 h放入同樣的電擊籠，但不給予任何應(yīng)激刺激。造模結(jié)束，于上午8：00前留取糞便標(biāo)本，然后使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測(cè)量股動(dòng)脈血壓后留取血液等標(biāo)本備用。

1.2.2 偽無(wú)菌鼠模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)［10］，使用四聯(lián)廣譜抗生素（Antibiotics，AB）制備偽無(wú)菌鼠。12只大鼠分為抗生素組（sham_AB）和應(yīng)激抗生素組（stress_AB），每組6只。在飲用水中加入1g/L氨芐西林、500 mg/L萬(wàn)古霉素、1 g/L新霉素、1 g/L甲硝唑四種抗生素（所有抗生素均購(gòu)自于Sigma公司），飲用水4 d更換一次。2周后，stress_AB組大鼠和stress組大鼠一起接受應(yīng)激；4周之后，收集大鼠糞便用于后續(xù)的測(cè)序分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法（ELISA） 檢測(cè)血漿去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，按梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品8個(gè)濃度，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別設(shè)空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔。空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同；標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL；待測(cè)樣品孔加血清100 μL?；靹?，封板，37℃，溫育30 min。洗滌5次，拍干。所有標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔各加酶標(biāo)試劑50 μL。37℃，溫育30 min，洗滌5次，拍干?？瞻讓?duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔按序依次加入顯色劑A 和B各50 μL，混勻，37℃，避光顯色15 min，加終止液50 μL用于終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。加終止液后15 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。酶標(biāo)儀設(shè)定在450 nm波長(zhǎng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD 值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式。根據(jù)樣品的OD 值計(jì)算樣品濃度。

1.2.4 腸道菌群測(cè)序及分析 每天上午8：00在超凈臺(tái)中采集大鼠的新鮮糞便于無(wú)菌凍存管中，所有樣品立即于-80℃保存?zhèn)溆?。所有樣品干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA的測(cè)序。引物名稱：338F_806R；F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；R端序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；長(zhǎng)度：468；測(cè)序方式：PE300。采用 Illumina MiSeq 測(cè)序技術(shù)，測(cè)定大鼠糞便中微生物 16S rRNA V3-V4 區(qū)序列，并對(duì)群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了比較分析。使用I-Sanger云平臺(tái)比較分析樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和差異［11］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，n表示大鼠的例數(shù)。兩組間單因素分析采用Student’s t-test檢驗(yàn)；血壓和心率等數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激性高血壓大鼠行為、體重、血壓、心率及NE的變化

應(yīng)激性高血壓組（stress組）大鼠每天接受2次應(yīng)激刺激，每次2 h，中間間隔4 h，持續(xù)14 d。與對(duì)照組（sham組）大鼠相比，stress組大鼠從第2天開(kāi)始就發(fā)生明顯的行為方面的改變。表現(xiàn)為高度警覺(jué)，躁動(dòng)不安。在電擊籠中，呼吸加深加快、體毛豎立，出現(xiàn)緊張恐懼和逃避行為，常表現(xiàn)為呈直立狀攀附在電擊籠側(cè)壁。而sham組大鼠行為正常，表現(xiàn)為悠閑狀態(tài)。無(wú)論是sham組還是stress組大鼠的體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是stress組大鼠的體重增長(zhǎng)緩慢。應(yīng)激造模14 d，與sham組大鼠相比，stress組大鼠體重增長(zhǎng)明顯低于sham組大鼠（圖1-C）。造模結(jié)束次日，使用PowerLab 8/35數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)測(cè)量sham組和stress組大鼠股動(dòng)脈血壓和心率。與sham組相比，stress組大鼠的血壓升高、心率增快（圖1-A-B）。大鼠處死前留取靜脈血5 mL，分離血清后-80℃?zhèn)溆?。使用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清NE含量，用于評(píng)價(jià)大鼠外周交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。與sham組相比，stress組大鼠血清NE含量顯著增高（圖1-D）。

圖1 應(yīng)激性高血壓大鼠血壓、心率、體重增長(zhǎng)及血清去甲腎上腺素的變化

2.2 慢性應(yīng)激降低大鼠腸道菌群α多樣性

α多樣性反映群落中所含物種的種類數(shù)目和群落中各物種的相對(duì)密度是否均勻。分別取sham組和stress組大鼠糞便，進(jìn)行群落多樣性測(cè)序及交互式分析。α多樣性分析顯示，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目少于對(duì)照組（圖2-A）；chao和ace 指數(shù)均小于對(duì)照組，表明群落豐富度低于對(duì)照組（圖2-B-C）；Shannon指數(shù)低于對(duì)照組，而Simpson指數(shù)高于對(duì)照組，說(shuō)明群落多樣性高于對(duì)照組（圖2-DE）；converge顯示對(duì)照組和應(yīng)激組的物種覆蓋度沒(méi)有差異（圖2-F）。結(jié)果顯示，引起高血壓的慢性應(yīng)激顯著降低了腸道菌群的豐富度。

2.3 慢性應(yīng)激改變大鼠腸道菌群OUT水平物種組成和β多樣性

通過(guò)Venn 圖分析應(yīng)激性高血壓大鼠與對(duì)照大鼠腸道菌群的物種組成，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群OTU數(shù)目為560種，低于stress組大鼠的613種，兩組共有的OTU數(shù)目為521種（圖3-A）。為了進(jìn)一步評(píng)估兩組樣本間OTU組成的相似性和差異性，進(jìn)行β多樣性分析，基于bray_curtis距離PCoA分析，應(yīng)激性高血壓大鼠各樣本在平面圖的分布區(qū)域與對(duì)照組明顯不同，相互距離較遠(yuǎn)，分界清楚（圖3-B），顯示了慢性應(yīng)激降低了大鼠腸道菌群物種數(shù)目，并改變了物種組成。

圖2 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠腸道菌群α多樣性的影響。

2.4 慢性應(yīng)激改變腸道菌群門水平的物種組成

慢性應(yīng)激14 d大鼠腸道菌群的組成發(fā)生顯著改變。用Circos圖反映各組Phylum（門）分類學(xué)水平下物種的分布比例情況，對(duì)照組和應(yīng)激組樣本中物種比較豐富，以厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主（圖4-A）。

抗生素制備的偽無(wú)菌鼠腸道菌群的豐度和多樣性顯著下降。Sham_AB和stress_AB組物種單一，基本均為變形菌門（Proteobacteria）（圖4-B）。用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H test）對(duì)4組樣本在Phylum（門）水平下進(jìn)行顯著性差異分析，與Circos圖結(jié)果一致，對(duì)照組和應(yīng)激組大鼠的優(yōu)勢(shì)菌是厚壁菌門和擬桿菌門，而sham_AB和stress_AB組的優(yōu)勢(shì)菌是Proteobacteria（圖4-C）。用PCA圖比較sham_AB和stress_AB組腸道菌群的β多樣性的結(jié)果顯示，sham_AB和stress_AB組樣本點(diǎn)非常接近，表明兩組物種組成在門水平相似（圖4-D），即飲用抗生素水的大鼠，腸道除了少量的變形菌門外，沒(méi)有其他菌群物種存在，提示慢性應(yīng)激不能明顯改變偽無(wú)菌大鼠的腸道菌群在門水平的組成。

圖3 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠腸道菌群組成和多樣性的影響

2.5 慢性應(yīng)激不改變偽無(wú)菌鼠BP、HR、體重及血清NE濃度

SD大鼠接受14 d的慢性足底電擊結(jié)合噪聲應(yīng)激后，血壓升高、心率加快、體重增長(zhǎng)緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加。飲用含四聯(lián)抗生素飲用水的偽無(wú)菌鼠，其血壓、心率、體重增長(zhǎng)及血清去甲腎上腺素濃度與正常飲水組大鼠相比，無(wú)顯著變化。飲用四聯(lián)抗生素水的偽無(wú)菌鼠接受相同應(yīng)激刺激后，未出現(xiàn)正常大鼠應(yīng)激后血壓升高、心率加快、體重增長(zhǎng)緩慢及血清去甲腎上腺素濃度增加的變化（圖5），顯示應(yīng)激引起的這些變化對(duì)腸道菌群的依賴性。

3 討論

本研究采用足底電擊結(jié)合噪聲刺激方法建立應(yīng)激性高血壓動(dòng)物模型。這一方法是國(guó)際上普遍認(rèn)可的大鼠應(yīng)激性高血壓造模方法［12-13］。本研究結(jié)果顯示，這種應(yīng)激方法，使大鼠血壓升高、心率增快，體重增長(zhǎng)緩慢，血清NE濃度增加，表明高血壓模型成功。大鼠糞便標(biāo)本應(yīng)用16S rRNA測(cè)序分析顯示，腸道菌群豐富度、多樣性下降，物種組成數(shù)目下降。大鼠飲用含四聯(lián)廣譜抗生素水一個(gè)月后，腸道菌群基本殺滅，成為偽無(wú)菌鼠。給予偽無(wú)菌鼠相同的足底電擊結(jié)合噪聲的慢性應(yīng)激，不再引起大鼠的血壓升高、心率增快和血清NE濃度增加。這些結(jié)果提示，應(yīng)激性高血壓的發(fā)生與腸道菌群的紊亂密切相關(guān)。

應(yīng)激可通過(guò)激活交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸引起血壓升高等應(yīng)激反應(yīng)［14-15］。本文通過(guò)足底電擊結(jié)合噪聲的方法建立的應(yīng)激性高血壓大鼠模型一般在電擊第5天開(kāi)始，血壓和心率就明顯升高，第10天達(dá)到峰值，持續(xù)應(yīng)激到14 d，期間的血壓和心率維持在最高水平。應(yīng)激性高血壓大鼠除了血壓和心率的變化，在行為上還表現(xiàn)為躁動(dòng)不安、警覺(jué)性增高、且易于激惹；在飲食上發(fā)現(xiàn)飲水增多，但食用飼料量減少，有厭食現(xiàn)象，因此體重增長(zhǎng)緩慢［16］。這些現(xiàn)象都顯示，應(yīng)激引起了交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活。就血壓而言，交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的激活最終通過(guò)增加外周交感神經(jīng)的活動(dòng)引起血壓升高。外周血中的NE濃度可反映交感活動(dòng)的狀態(tài)。我們使用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清NE濃度，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性高血壓大鼠血清NE濃度明顯增加，說(shuō)明交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，是應(yīng)激引起血壓升高的機(jī)制。

圖4 抗生素對(duì)腸道菌群豐度和多樣性的作用

研究表明，應(yīng)激改變腸道菌群［17］。菌群介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)得到了用益生菌和/或抗生素處理的無(wú)菌小鼠等嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的支持。無(wú)菌成年小鼠可放大應(yīng)激誘導(dǎo)的腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮的釋放，無(wú)菌小鼠的這種應(yīng)激反應(yīng)可以通過(guò)移植對(duì)照動(dòng)物的糞便部分逆轉(zhuǎn)［18］。益生菌降低大鼠急性應(yīng)激時(shí)的腸道通透性和下丘腦-垂體-腎上腺軸反應(yīng)［19］；給予成年人補(bǔ)充益生菌植物乳桿菌P8可緩解壓力和焦慮，提高社會(huì)情緒認(rèn)知、口頭學(xué)習(xí)和記憶能力，降低血漿皮質(zhì)醇水平和促炎細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α等水平［20］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群的OTU數(shù)目下降，α多樣性分析顯示應(yīng)激引起菌群的豐富度下降；通過(guò)β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群多樣性下降，且引起了菌群物種組成與正常組明顯差異。這些改變提示，應(yīng)激引起了腸道菌群紊亂。高血壓的發(fā)生與腸道菌群的變化相關(guān)［7］的研究提示，應(yīng)激引起的腸道菌群紊亂可能是應(yīng)激性高血壓的原因。為了進(jìn)一步探討應(yīng)激引起的腸道菌群變化與應(yīng)激性高血壓的發(fā)生存在因果關(guān)系，我們將四聯(lián)廣譜抗生素加在大鼠飲用水中4周，制備偽無(wú)菌鼠。使用抗生素清除腸道菌群是觀察菌群在疾病發(fā)生機(jī)制中的一種方法，比直接使用無(wú)菌鼠更便于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。本研究使用抗生素的時(shí)間較長(zhǎng)，一是應(yīng)激性高血壓造模周期需2周時(shí)間，二是盡可能清除腸道菌群。本文對(duì)使用四聯(lián)抗生素4周大鼠糞便的進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析顯示，僅存少量的變形菌門，基本達(dá)到無(wú)菌的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，引起正常大鼠產(chǎn)生高血壓的慢性應(yīng)激方法不再引起偽無(wú)菌大鼠的交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)、血壓升高，這一結(jié)果表明，腸道菌群參與了應(yīng)激性高血壓的發(fā)生。雖然許多研究都顯示，腸道菌群紊亂與人和動(dòng)物高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，但腸道菌群紊亂引起高血壓的機(jī)制還不清楚［21］。最近的文獻(xiàn)表明，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）參與高血壓的調(diào)節(jié)，腸道菌群紊亂引起SCFAs減少可能成為血壓升高的因素［5，22］。在血管緊張素 II誘發(fā)的高血壓小鼠模型中，補(bǔ)充丁酸鹽可顯著降低血壓，而高血壓患者循環(huán)丁酸鹽降低［23］。SCFAs可通過(guò)通過(guò)分布在腎臟或血管內(nèi)膜上的受體對(duì)血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)［24］。臨床研究顯示通過(guò)高纖維食物補(bǔ)充SCFAs具有抗高血壓的作用［25］。腸道菌群紊亂可能導(dǎo)致交感神經(jīng)活性增加而成為高血壓的機(jī)制［26］。我們過(guò)去的工作表明，下丘腦室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的神經(jīng)炎癥是應(yīng)激性高血壓發(fā)生的重要機(jī)制［13］，下丘腦室旁核促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞增多，炎癥因子表達(dá)增加丁酸具有抑制促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，在應(yīng)激情況下，是否由于腸道丁酸的減少，影響室旁核神經(jīng)炎癥的機(jī)制引起血壓的改變等，都有待進(jìn)一步探討。

圖5 慢性應(yīng)激對(duì)偽無(wú)菌大鼠血壓、心率、體重增加及血清去甲腎上腺素濃度的變化

4 結(jié)論

應(yīng)激性高血壓大鼠腸道菌群豐富度和多樣性下降，菌群物種組成變少，差異性變大?？股靥幚硇纬傻膫螣o(wú)菌鼠，腸道菌群物種單一，僅有少量的變形菌門。給予偽無(wú)菌鼠慢性應(yīng)激，不再引起大鼠血壓升高，心率增快，血清去甲腎上腺素濃度未升高。這提示了應(yīng)激性高血壓的發(fā)生對(duì)腸道菌群的依賴性。