小龍蝦腸道產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離與鑒定

馮光志 石慧 劉博 吳玉婷 王月琳 石玉

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205）

纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一［1］。我國(guó)擁有豐富的纖維素資源，但因不能得到及時(shí)有效的利用，不僅造成了資源浪費(fèi)，也給自然環(huán)境帶來(lái)了巨大威脅［2］。纖維素酶屬于一種多酶復(fù)合體，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase，EG），外切 β-1，4-葡聚糖酶（Exglucanase，CBH）和β-1，4-葡聚糖酶（β-glucosidase，簡(jiǎn)稱(chēng) BG）3種，只有和組分酶共同作用時(shí)才能將纖維素徹底水解為葡萄糖并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)［3］。通過(guò)微生物產(chǎn)酶降解纖維素具有反應(yīng)條件溫和，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)［4］。目前，從自然界中獲取的纖維素降解菌，由于其酶產(chǎn)量、酶穩(wěn)定性、酶系組成和酶的催化效率等因素限制，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株非常有限，纖維素酶的生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)的需求。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱(chēng)小龍蝦，屬甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、蝲蛄科（Cambaridae）、原螯蝦屬（Procambarus）動(dòng)物［5］。目前，小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，由最初的養(yǎng)殖和簡(jiǎn)單的加工出口不斷發(fā)展完善，成為集育苗、養(yǎng)殖、加工、餐飲、銷(xiāo)售、休閑旅游、文化等為一體的綜合產(chǎn)業(yè)。然而，小龍蝦養(yǎng)殖大都仍采用玉米、小麥、野雜魚(yú)等天然餌料或其他蝦蟹飼料替代以及一些人工配合飼料產(chǎn)品，存在飼料利用率低，糞便污染養(yǎng)殖環(huán)境，小龍蝦生長(zhǎng)性能低下等問(wèn)題。從小龍蝦腸道中分離高產(chǎn)纖維素酶的土著細(xì)菌，制備小龍蝦腸道微生物源微生物制劑，開(kāi)發(fā)小龍蝦專(zhuān)屬功能飼料已迫在眉睫。小龍蝦為雜食性動(dòng)物，在天然條件下主要攝食有機(jī)物碎屑、藻類(lèi)、水生植物的根、葉及碎片，特別喜食汁多肥嫩的綠色植物，如水浮蓮、綠萍和水葫蘆等，可見(jiàn)小龍蝦具有很強(qiáng)的纖維素降解能力。小龍蝦腸道微生物是小龍蝦降解纖維素和半纖維素的主要驅(qū)動(dòng)力。因此，在小龍蝦腸道內(nèi)有望篩選到高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株，服務(wù)于小龍蝦飼料產(chǎn)業(yè)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)克氏原螯蝦的研究主要集中于其行為學(xué)［6-7］、種群結(jié)構(gòu)與分布［8-9］及疾病與免疫方面［10-12］，對(duì)營(yíng)養(yǎng)飼料方面的研究也主要集中在蛋白質(zhì)、脂肪等方面［13］，而對(duì)于小龍蝦腸道細(xì)菌的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。本研究采用純培養(yǎng)法，從小龍蝦腸道中分離篩選產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)初步鑒定，對(duì)高活性菌株進(jìn)行基因組掃描分析，一方面期望獲得全新的高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株以及基因資源；另一方面，也為研究小龍蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)和纖維素的降解機(jī)制提供理論支撐，為創(chuàng)制新型小龍蝦飼料開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小龍蝦取自本校小龍蝦養(yǎng)殖基地蝦池。養(yǎng)殖基地位于湖北省武漢市湯遜湖旁，共有8個(gè)10 m×5 m的蝦池。投喂飼料購(gòu)自湖北渴望牧業(yè)有限責(zé)任公司，扶龍牌龍蝦配合飼料。

1.1.2 主要試劑和儀器以及培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×TaqMasterMix，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；PCR 儀，Bio-Rad公司。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母抽提物5 g，溶于1 L雙蒸水中，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g，1×105Pa滅菌20 min。篩選培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨2.0，NaCl 2.0，酵母抽提物1.0，pH 7.0，瓊脂粉15.0，羧甲基纖維素鈉 10.0，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌的篩選 選取10只小龍蝦，用70%酒精、無(wú)菌水依次清洗體表。拉出整個(gè)腸道，放于無(wú)菌離心管中。用滅菌的勻漿棒冰上勻漿，充分勻漿后的液體即為小龍蝦全腸菌懸液。將小龍蝦全腸菌懸液稀釋涂平板，梯度從10-2-10-7，每個(gè)梯度涂?jī)蓚€(gè)平行。在28℃的恒溫箱中進(jìn)行倒置培養(yǎng)2 d。將LB培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌分類(lèi)標(biāo)記后，用牙簽點(diǎn)在添加1%羧甲基纖維素鈉的篩選培養(yǎng)基上，28℃的恒溫箱中倒置培養(yǎng)24 h。用沾了酒精的紙板輕輕刮去培養(yǎng)基表面的菌體，剛果紅染色15 min，NaCl脫色30 min，觀察水解圈的形成。將有水解圈的菌落在篩選培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行分離純化。記錄水解圈直徑和菌落直徑大小，并將純化的菌種-80℃甘油保藏。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)所篩選的菌株13和菌株33分別進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和顯微觀察，進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步判斷所篩選菌株的科屬。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增［14］。PCR結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 菌株33基因組掃描測(cè)序 提取菌株33基因組DNA，采用 Illumina Hiseq 4000 測(cè)序技術(shù)完成菌株的基因組掃描測(cè)序，構(gòu)建 Illumina PE 文庫(kù)（300 bp-500 bp文庫(kù)），對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后利用生物信息學(xué)分析手段完成菌株碳水化合物相關(guān)酶基因掃描。

2 結(jié)果

2.1 小龍蝦腸道產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離與篩選

在篩選培養(yǎng)基平板中，菌株能夠利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)并產(chǎn)生纖維素酶，使培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素水解并形成透明圈。水解圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株產(chǎn)纖維素酶能力比較強(qiáng)，反之較弱。從表1中可以看出菌株33產(chǎn)酶能力最大，其次是菌株13、27、22、25、31，菌株29產(chǎn)酶能力最小。

表1 篩選菌株水解圈大小

2.2 分離菌株的鑒定結(jié)果與分析

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 選取產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的2個(gè)菌株13和33號(hào)，進(jìn)行革蘭氏染色以及芽孢染色，結(jié)果如圖1，13和33號(hào)菌株均能產(chǎn)芽孢。菌株13號(hào)菌落表面濕潤(rùn)、菌落乳白色，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢；菌株33菌落形態(tài)呈現(xiàn)白色、圓形、扁平狀態(tài)，菌落均勻不透明且邊緣整齊，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將篩選菌株進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，得到約1 500 bp的PCR產(chǎn)物（圖2）。根據(jù)NCBI的BLAST比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）可知，菌株13為貝萊斯芽孢桿菌，菌株33屬于枯草芽孢桿菌，皆與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相吻合。

節(jié)點(diǎn)左邊的數(shù)值是基于鄰接法1 000次重復(fù)取樣數(shù)據(jù)集的Bootstrap支持率；比例尺0.01表示1 000個(gè)核苷酸中有10個(gè)被替換；括號(hào)內(nèi)的序號(hào)表示相應(yīng)序列在GenBank的登錄號(hào)。

圖1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果（×1 000）

圖2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

圖3 菌株13、33的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株33基因組掃描測(cè)序

2.3.1 菌株33基因組概況 采用 Illumina Hiseq4000測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品的 DNA 進(jìn)行 paired-end（PE）測(cè)序，構(gòu)建300 bp-500 bp 文庫(kù)，利用 SOAPdenovo v2.04和velvet 拼接軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行組裝，通過(guò) Glimmer 3.02軟件進(jìn)行細(xì)菌的基因預(yù)測(cè)，測(cè)序數(shù)據(jù)和基因預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株33測(cè)序數(shù)據(jù)和基因信息

2.3.2 菌株33基因組碳水化合物相關(guān)酶（CAZy）的基因注釋 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)業(yè)收集各種碳水化合物酶類(lèi)，目前，數(shù)據(jù)庫(kù)包含糖苷水解酶類(lèi)（GHs）、糖苷轉(zhuǎn)移酶類(lèi)（GTs）、多糖裂解酶類(lèi)（PLs）、糖水化合物酯酶類(lèi)（CEs）、碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）和輔助模塊酶類(lèi)（AAs）6大類(lèi)家族，其同源家族數(shù)目分別達(dá)到了 149、105、27、16、83 和 14 個(gè)。使用 HMMs 方法在所獲得的蛋白質(zhì)序列中鑒定 CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中含有的各種酶類(lèi)的結(jié)構(gòu)信息，從而鑒定菌株33基因組中碳水化合物相關(guān)酶基因，并將這些按照種類(lèi)分為 6 大類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表3。菌株33基因組含有較多的碳水化合物相關(guān)酶基因，分屬于6大類(lèi)家族，其中糖苷水解酶類(lèi)包含GH1、GH4、GH23、GH26等32個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)69個(gè)；碳水化合物結(jié)合模塊包含CBM16、CBM16、CBM50等12個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)47個(gè)；糖苷轉(zhuǎn)移酶類(lèi)包含GT2、GT4、GT26等12個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)43個(gè)；糖水化合物酯酶類(lèi)包含CE1、CE7、CE12等9個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)30個(gè)；輔助模塊酶類(lèi)包含AA4、AA6和AA7三個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)8個(gè)；多糖裂解酶類(lèi)包含PL1-6、PL3-1、PL26等6個(gè)家族，同源家族數(shù)目達(dá)7個(gè)。菌株33含有豐富的碳水化合物相關(guān)酶基因資源，通過(guò)研究這些基因的表達(dá)調(diào)控，可以揭開(kāi)菌株33降解纖維素的機(jī)制，也有望獲得新的高效表達(dá)的纖維素酶基因資源。

3 討論

表3 菌株33碳水化合物相關(guān)酶的基因

纖維素由數(shù)百至數(shù)千個(gè)葡萄糖分子聚合而成，是地球上存在最豐富的有機(jī)大分子［15］。纖維素酶能夠水解纖維素為葡萄糖并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。隨著生物技術(shù)在工業(yè)中的發(fā)展，纖維素酶被廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)、食品醫(yī)藥、制漿造紙、能源工業(yè)等行業(yè)，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［16］。然而，目前工業(yè)應(yīng)用的一些纖維素酶產(chǎn)品，受到酶的特性限制，如酶產(chǎn)量、酶穩(wěn)定性、酶系組成和酶的催化效率等因素，阻礙了這些纖維素酶產(chǎn)品在一些行業(yè)中的推廣；一些產(chǎn)纖維素酶菌株也由于其自身的生理特性而在某些行業(yè)得不到應(yīng)用。因此，根據(jù)行業(yè)發(fā)展，篩選新的適合行業(yè)需求的高效纖維素降解菌和纖維素酶基因資源，仍然具有十分重要的意義，也有望解決纖維素酶產(chǎn)量和活性不高，纖維素酶降解菌不能定植等問(wèn)題。以小龍蝦行業(yè)為例，小龍蝦飼料的產(chǎn)業(yè)發(fā)展制約著小龍蝦行業(yè)的革新。目前，小龍蝦養(yǎng)殖大都采用野雜魚(yú)、玉米、小麥等天然餌料或其他蝦蟹飼料替代進(jìn)行飼喂［17］，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，小龍蝦人工配合飼料的開(kāi)發(fā)也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。但是，迄今為止，有關(guān)小龍蝦飼料方面的研究，主要集中在蛋白質(zhì)和脂肪需求等方面，但未見(jiàn)有小龍蝦功能性飼料的相關(guān)報(bào)道。許多研究也表明，土著微生物對(duì)固有環(huán)境具有更好的適應(yīng)性，土著腸道微生物更容易在宿主腸道中定植，從而起到和宿主的互利共生作用［18］。從小龍蝦腸道中分離高產(chǎn)消化酶的土著細(xì)菌，制備小龍蝦腸道微生物源微生物制劑，開(kāi)發(fā)小龍蝦專(zhuān)屬功能飼料已迫在眉睫。

腸道不僅是生命體吸收、消化和進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所，也是機(jī)體與外界環(huán)境聯(lián)系最緊密的器官之一［19］。腸道微生物棲居于腸道內(nèi)，與宿主形成共生關(guān)系，在宿主營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)代謝和免疫抗病等方面都發(fā)揮著重要作用［20-21］。隨著人們對(duì)腸道微生物的重視程度日益提高，關(guān)于腸道微生物的研究也逐漸增多。關(guān)于腸道微生物的功能研究，主要有兩個(gè)方面：一是腸道菌群的研究，可以了解腸道微生物的結(jié)構(gòu)與組成，為研究微生物的功能以及在腸道中發(fā)揮的作用提供指導(dǎo)，筆者在先前的研究中，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了小龍蝦腸道細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，小龍蝦腸道細(xì)菌主要是Candidatus Bacilloplasma、擬桿菌屬、弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、Dysgonomonas、Tyzzerella 3、氣單胞菌屬細(xì)菌，為小龍蝦腸道微生物的功能研究提供了一定參考［22］；另一方面是腸道功能微生物的研究，本研究中從小龍蝦腸道中篩選出7株產(chǎn)纖維素酶菌株，對(duì)產(chǎn)酶活性較高的2株菌株13、33進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，其中菌株13為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株33為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類(lèi)產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧生活。芽孢桿菌屬不是小龍蝦腸道核心菌群，但是芽孢桿菌屬細(xì)菌在小龍蝦腸道降解纖維素過(guò)程中發(fā)揮著一定功能。小龍蝦以植物根、葉為食，腸道中生存著大量的纖維素降解細(xì)菌，從小龍蝦腸道中篩選產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌，有望獲得全新的纖維素酶菌株資源和基因資源，它們對(duì)于小龍蝦腸道微生物源專(zhuān)屬飼料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用也具有十分重要的意義。菌株33具有多種水解酶活性，并有較高的纖維素降解能力，高通量測(cè)序結(jié)果表明該菌基因組含有許多碳水化合物相關(guān)酶基因。通過(guò)研究這些基因的表達(dá)調(diào)控，可以弄清菌株33降解纖維素的機(jī)理，探明其在小龍蝦腸道內(nèi)降解纖維素過(guò)程中發(fā)揮的作用。同時(shí)，對(duì)這些纖維素酶基因進(jìn)行克隆和外源表達(dá)，也有望獲得可以工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶產(chǎn)品。結(jié)果也表明該菌基因組中含有許多碳水化合物相關(guān)酶基因，后續(xù)可以對(duì)菌株33的纖維素酶基因進(jìn)行體外分子改良及高產(chǎn)纖維素酶活性內(nèi)源性益生菌的構(gòu)建，以期提高飼料利用率。

4 結(jié)論

本研究從小龍蝦腸道中篩選到7株產(chǎn)纖維素酶菌株，對(duì)產(chǎn)酶活性較高的2株菌株13、33進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，其中菌株13為貝萊斯芽孢桿菌，菌株33為枯草芽孢桿菌，菌株33具有多種水解酶活性，并有較高的纖維素降解能力，表明小龍蝦腸道中含有豐富的纖維素降解菌，芽孢桿菌屬細(xì)菌占據(jù)著一定比重，從小龍蝦腸道中有望篩選到可以應(yīng)用于飼料工業(yè)的優(yōu)良菌株。菌株33高通量測(cè)序